甘薯肉桂酸—4—羟化酶基因克隆及序列分析

张华玲 刘绪 杨春贤 黄元射 傅玉凡 张启堂

摘 要：肉桂酸-4-羟化酶（Cinnamic acid-4-hydroxylase， C4H，EC 1.14.13.11）是苯丙烷途径中第二步反应酶，同时也是花色素苷前体生物合成途径中关键酶。该研究根据植物C4H的同源序列设计引物，通过RT-PCR结合RACE的方法，在紫色甘薯中获得了与其相应的C4H基因，命名为IbC4H（GenBank 登录号GQ373157）。结果表明：（1）序列分析表明IbC4H长1 668 bp，编码505个氨基酸，该氨基酸序列与其cDNA序列与IbC4H蛋白与马铃薯C4H蛋白序列最为接近，与苹果、黑莓、大阿米芹、油菜一致性很高，均在70%以上。（2）二级结构预测表明α-螺旋和无规则卷曲是IbC4H蛋白最大量的结构元件，而延伸链则散布于整个蛋白中。（3）三维结构建模预测，IbC4H蛋白具备细胞色素P450氧和铁离子结合位点等典型的C4H结构。该研究结果为进一步了解花色素苷生物合成途径中的作用奠定了基础，也为花青素生物合成分子机理和代谢调控提供了靶位点和理论参考。

关键词：甘薯， 肉桂酸-4-羟化酶， 基因克隆， 序列分析

中图分类号：Q943.2

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）04-0501-08

Abstract：（Cinnamic acid-4-hydroxylase ， C4H，EC 1.14.13.11） is the second key enzyme involved in the biosynthetic pathway of phenylpropanoid and precursors of anthocyanin biosynthesis. Based on cDNA sequence conserved domain of C4H，a pair of primers were designed and used to amplify a fragment of IbC4H gene （GenBank accession：GQ373157） by RT-PCR from sweet potato using RT-PCR and RACE technique. A 1 668 bp full-length cDNA sequence was obtained. Analysis of C4H cDNA indicated that it encoded a peptide containing 505 amino acids and the sequence comparison with the C4H gene of potatoes， apples， blackberries， ammi majus and rapes showed that identity was all above 70%. The predicted secondary structure demonstrated that alpha helix and random coil were the most important structural conformation. However， extended chain distributed in the whole protein. The predicted tertiary structure demonstrated that IbC4H had binding sites of cytochrome P450 with oxygen and iron. The study will be helpful to understand more about the roles involved in anthocyanin biosynthesis at the molecular level and provides a candidate genes for metabolic engineering of anthocyanin biosynthesis pathway in purple-fleshed sweetpotato.

Key words：sweet potato， cinnamic acid-4-hydroxylase， gene cloning， sequence analysis

甘薯，學名（Ipomoea batatas），是旋花科（Convolvulaceae）甘薯属（Ipomoea）中的一个栽培种，具有蔓生习性的一年生（温带）或多年生（热带）草本、双子叶植物（Woolfe， 2008）。甘薯薯肉色泽鲜艳，种类繁多，其中一类为紫色甘薯，富含花色素苷。花色素苷理化性质稳定，具有抗氧化活性、预防肿瘤和癌症等多种生理功能，在食品着色、医药保健、化妆品方面有着较大的应用潜力（肖素荣和李京东，2009）。

肉桂酸-4-羟化酶（C4H，EC1.14.13.111）是苯丙烷途径的第2个关键酶，同时也是花色素苷前体生物合成途径中的关键酶（陈鸿翰等，2013）。C4H催化反式肉桂酸的反应形成4-N基肉桂酸，也是第一个氧化反应。肉桂酸-4-羟化酶在细胞中含量的多少，直接影响多条代谢支路。苯丙烷途径的核心关键酶形成一个复合物，而C4H在苯丙烷途径（位于胞质中）与电子传递反应（位于膜上）之间起到重要作用（陈安和，2006）。C4H的克隆及代谢研究在白木香（梁良等，2014）、青稞（罗小娇等，2014）、油菜（陈安和，2006）、烟草（Annette et al， 2007）、马铃薯（Boddu et al， 2004）、苦荞（陈鸿翰等，2013）和菘蓝（胡永胜等，2015）等物种已有报道，但未见甘薯中克隆。为了进一步揭示花色素苷合成的分子机制，丰富花色素苷生物合成途径中的相关酶体系基因，本研究以紫色甘薯为材料，采用RT-PCR和RACE技术克隆甘薯C4H基因，命名为IbC4H（GenBank登录号：GQ373157），并进行生物信息分析，旨在为构建植物表达载体、转化做准备，从而为利用分子育种方法提高花色素苷的含量提供有益信息。

1 材料与方法

1.1 材料

该实验材料由西南大学甘薯工程研究中心提供，富含花色素的紫色甘薯新品种‘渝紫263（张启堂等，2004）。选取幼嫩部分叶片，经液氮速冻处理后保存在-80 ℃冰箱中备用。

1.2 甘薯中C4H的获得

‘渝紫263的RNA根据RNA提取试剂盒（北京天根）上的说明书进行提取，按照RNA PCR （AMV） Ver. 3.0 （TaKaRa 公司）的使用说明进行反转录获得cDNA链，-20 ℃保存。NCBI在线查找马铃薯、拟南芥、藿香、茶树、燕麦、喜树、芸香等植物的C4H全长cDNA的编码区序列（coding sequence，CDS），利用Vector NTI Suite 8.0对C4H核苷酸序列进行多重比对，选取其合适的保守位点进行核心引物设计，进而设计3′端、5′端及全长的引物。由上海英骏生物技术有限公司合成引物，引物序列如表1所示。引物设计方法以及序列的扩增方法及扩增条件参照苦荞黄烷酮3-羟化酶基因F3H的克隆及序列分析文章（张华玲等，2010）进行， PCR检测后由Invitrogen公司测序。

以‘渝紫263叶片的cDNA为模板，以C4H-f、C4H-r核心引物进行PCR核心片段的扩增。C4H核心片段扩增条件作出修改，预变性时间为5 min，退火温度设为50～60 ℃，54.5 ℃退火45 s，30个循环。将PCR产物回收纯化，克隆至载体中，制作大肠杆菌DH5α感受态细胞，将连接产物转入，鉴定菌落并测序。接着进行3′和5′ RACE扩增， 3′ RACE的二次扩增循环次数改为30个循环；5′ RACE 条件做一定修改，退火阶段72 ℃延伸1 min，34个循环； 最后72 ℃延伸10 min进行5′RACE的二次扩增。最后以全长引物C4H-fl-f、C4H-fl-r为引物，cDNA第一链为模板进行PCR反应，94 ℃预变性10 min； 94 ℃变性 45 s，64.5 ℃退火 45 s，72 ℃延伸10 min，34个循环扩增全长序列。

1.3 生物信息学分析

EditSeq软件序列分析与拼接后，将甘薯C4H的核苷酸序列和氨基酸序列在NCBI中BLAST比对，接着利用Vector NTI 8.0软件进行甘薯C4H及其他植物C4H的氨基酸序列进行多重比对，分析相似性。从GenBank中查找得到10个植物物种的C4H蛋白氨基酸序列，根据Neighber-joining方法（MEGA7）将IbC4H与它们构建系统进化树，bootstrap检验重复次数为1 000次，从而分析得到不同物种中的C4H基因之間的分子进化关（Kumar et al，2001）。ProtScale进行甘薯C4H基因编码蛋白的氨基酸序列疏水性预测，在GOR和Target P上进行二级结构分析和亚细胞定位分析，IbC4H结构的三维建模利用SWISSMODEL在线程序进行，利用ViewerLite 4.2 软件进行编辑，得到甘薯C4H三级结构模型。

甘薯C4H生物信息学分析参照张华玲等（2010）的苦荞黄烷酮3-羟化酶基因F3H的克隆及序列分析方法进行。

2 结果与分析

2.1 甘薯C4H的编码序列的获得及生物信息学分析

以紫薯叶片反转得到cDNA，采用简并引物对其扩增获得长为524 bp的甘薯C4H基因核心片段，并通过NCBI进行BLAST比对，比对结果显示该序列与来源于马铃薯（EU391448）等的cDNA序列同源性高达80%，表明已成功扩增IbC4H核心片段。根据IbC4H核心片段序列信息，设计5′RACE引物和3′RACE分别扩增得到534 bp左右的5′端和743 bp左右的3′端，用Edit Seq软件进行序列分析，将核心片段、3′端和5′端拼接获得全长1 668 bp，包括65 bp 5′端UTR、1 518 bp编码区、85 bp的3′端UTR和14 bp的polyA尾巴（图1）。根据该序列设计引物，扩增cDNA全长序列并进行BLAST比对。比对结果显示与藿香（Agastache rugosa，GenBank AY616436.1）和爬山虎（Parthenocissus henryana， DQ211885.1）相似性均为81%；与火炬松（Pinus taeda，AY764841.1）相似性为80%；与银合欢（Leucaena leucocephala，GU183363.1）和黑莓（Rubus occidentalis）为79%；与插田泡（R. coreanus，GenBank EU123533.1）和苹果梨（Malus × domestica，GenBank DQ075002.1）为78%；长春花 （Catharanthus roseus GenBank Z32563.1）77%；与油菜（Brassica napus，GenBank DQ485129.1），芜菁（B. rapa ，GenBank AB300317.1），大阿米芹（Ammi majus，GenBank AY219918.1）和香芹（Petroselinum crispum，GenBank L38898.1）均为76%。

利用DNAman软件进行分析，从图2可以看出，IbC4H的cDNA序列含有66～1 583 bp的开放阅读框以及85 bp的3′非编码区和65 bp的5′非编码区。IbC4H终止密码子为TAA，共编码505个氨基酸，符合有效翻译的基因全长cDNA特征。

IbC4H氨基酸序列提交http：//www.expasy.org预测，分子量58.16 kD，等电点为9.23，其中95个极性氨基酸和190个疏水性氨基酸残基。疏水性蛋白，亚细胞定位预测在细胞质。

2.2 不同植物的C4H氨基酸序列多重比对

利用Vector NTI 8.0软件对甘薯和其他植物的C4H氨基酸序列进行多重比对，并分析它们的相似性（图3）。由图3可知，IbC4H与马铃薯C4H序列相似性最高，与苹果、黑莓较为接近，而与大阿米芹、油菜差异稍微大些，但是一致性仍很高，均在70%以上，可见C4H编码区高度保守，从而进一步证明所克隆出的基因确实是甘薯C4H基因。分析由于这些植物生长过程需积累大量黄酮类化合物，而C4H是催化类黄酮前体肉桂酸合成的重要酶，推测其基因必须保持足够的遗传稳定性和演化趋向性。

2.3 C4H分子系统发生树分析

将IbC4H与从GenBank中得到了黑莓（Rubus occidentalis，GenBank FJ554629.1）、插田泡（R. coreanus，GenBank EU123533.1）、苹果梨（Malus × domestica，GenBank DQ075002.1）、长春花 （Catharanthus roseus， GenBank Z32563.1）、甘薯（Ipomoea batatas， GenBankGQ373157.1）、马铃薯（Solannum tuberosum，GenBank：DQ341174.1）、大阿米芹（Ammi majus， GenBank AY219918.1）、香芹（Petroselinum crispum， GenBank L38898.1）、油菜（Brassica napus， GenBank DQ485129.1）和芜菁（B. rapa， GenBank AB300317.1） 10个植物物种的C4H蛋白序列，用Neighber-joining方法（MEGA7）构建了系统进化树，用以分析不同物种中的C4H基因之间的进化关系（图4），Bootstrap检验的重复次数为1 000次。结果显示IbC4H与茄科马铃薯C4H蛋白相似性最高，进化树上遗传距离也最为接近，聚为一类。树莓、插田泡、苹果同为蔷薇科植物，所以聚为一大类，并且这类植物和长春花有相同的特点，即色泽鲜艳，富含花青素。IbC4H位于花色素途径的上游，除了与合成黄酮类化合物进而合成花青素有关，还与合成木质素紧密相关，而木质素中一个重要的成分就是纤维素。因此，和富含纤维素的芹菜、芫荽，还有油菜、芜菁也有一定关联。其中芹菜、芫荽同为聚伞房花科，聚为一类；而油菜、芜菁同为十字花科，聚为一类。在进化树上不仅与所属科属类别亲缘关系相近，也和BLAST和多重比对结果相符。

2.4 IbC4H的蛋白结构分析

根据IbC4H的二级结构预测，在IbC4H多肽链中含有44.55%的α-螺旋， 13.47%的延伸链，和41.98%的无规则卷曲。纵观蛋白的整体结构，α-螺旋和无规则卷曲是IbC4H蛋白最大量的结构元件，而延伸链则散布于整个蛋白中（图5）。用TMHMM Server对甘薯基因C4H功能结構域分析，甘薯C4H肽链在细胞膜外，IbC4H不存在跨膜结构域。用ProtScale进行甘薯C4H基因编码蛋白的氨基酸序列预测，整条多肽链表现为输水性，在N端和近C端有较为明显的输水区域。在PROSITE中分别预测，IbC4H含有细胞色素P450血红素半胱氨酸铁元素结合位点（440～449位氨基酸残基）、N-糖基化位点（57～60位、272～275位氨基酸残基）、依赖于CAMP-CGMP蛋白激酶磷酸结合位点（262～265位氨基酸残基）。此外，还含有蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、酰胺化位点。三维结构建模预测， 丙氨酸306位残基所在侧链，苯丙氨酸119位残基及丝氨酸120残基，天冬氨酸294位残基，苏氨酸310位残基，苯丙氨酸203位残基共同形成一个穴状的结构，其中苏氨酸和天冬氨酸参与水分子的氢键的连接，增加结构稳定性。丝氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸是酶的结合位点，该催化中心含有水分子、氧及铁元素结合位点，和其它关于人类细胞色素P450氧化及相关结构模型研究结果相一致（Wilmouth et al，2002； Stefaan et al，2007； Linda et al，1986）。

3 讨论

花色素苷合成要经由苯基丙酸路径和类黄酮生合成途径生成，除合成木质素、类黄酮物质，还合成香豆素、绿原酸等物质，作为植物的信号分子或拮抗物质。肉桂酸-4-羟化酶催化反式肉桂酸的反应形成4-N基肉桂酸，是苯丙烷途径的第2个关键酶，属于细胞色素单加氧酶超家族。苯丙烷途径的核心关键酶形成一个复合物，C4H在苯丙烷途径（位于胞质中）与电子传递反应（位于膜上）之间起着重要作用（梁良等，2014；陈安和，2006）。Blount et al（2000）的研究表明，转基因烟草中肉桂酸-4-羟化酶酶过量表达将导致绿原酸的含量的增加。目前已对拟南芥、水稻、油菜、青稞、大豆等多种植物C4H基因进行了分离和克隆，（Annette et al， 2007； Boddu et al， 2004；罗小娇等，2014； 王安娜等，2010）。谭国飞等（2014）通过定量、半定量PCR，检测C4H基因在不同组织中的表达，如鸭儿芹中基因与温度的响应表达，为其生长环境的分析提供了重要依据；利用实时荧光定量PCR 分析青稞C4H在胚乳发育不同组织的表达情况，对品种改良等有重要意义（罗小娇等，2014）。本研究成功克隆了紫色甘薯C4H基因，同时进行了生物信息学分析，为利用植物次生代谢途径中关键酶的“基因修饰”技术， 调节甘薯C4H的活性来增加色素的含量及黄酮类含量奠定了基础，目前，在甘薯中C4H的表达水平与黄酮和紫色色素积累量的关系有待进一步研究分析，后期还将研究紫薯花色素苷合成途径中其他关键基因，分析其表达与花色素苷总量的关系，探究黄酮类化合物生物合成的分子调控网络，从而对天然色素新品种的研发提供重要依据。

参考文献：

ANNETTE R， MICHAEL A， JOSEPH I， et al， 2007. Purification， cloning and characterization of a novel peroxidase isozyme from sweetpotatoes （Ipomoea batatas） [J]. Biochim et Biophy Acta （BBA）-Proteins， 1774（11）：1422-1430.

BLOUNT JW，KORTH KL， MASOUD SA， et al， 2000， Altering expression of cinnamic acid 4-hydroxylase in transgenic plants provides evidence for a feedback loop at the entry point into the phenylpropanoid pathway [J]. Plant Physiol， 122：107-116.

BODDU J， SVABEK C， SEKHON R， et al， 2004. Expression of a putative flavonoid 3-hydroxylase in sorghum mesocotyls synthesizing 3-deoxyanthocyanidin phytoalexins [J]. Physiol Mol Plant Pathol， （65）：101-113.

CHEN HH， YUAN MQ， LI SJ， et al， 2013. Cloning of cinnamate 4-hydroxylase Gene（C4H） from tartary buckwheat （Fagopyrum tararicum） and its tissue-specific expression under UV-B stress during seed germination [J]. Agric Biotechnol， 21（2）：137-147 . [陈鸿翰， 袁梦求， 李双江， 等， 2013. 苦荞肉桂酸羟化酶基因（FtC4H）的克隆及其UV-B胁迫下的组织表达 [J]. 农业生物技术学报，21（2）：137-147.]

CHEN AH，2006. Cloning and comparative genomic study of C4H gene families of Brassica napus and its parental species [D]. Chongqing：Southwest University：15-25. [陈安和， 2006. 甘蓝型油菜及其亲本物种C4H基因家族克隆及比较基因组学研究 [D]. 重庆：西南大学：15-25.]

HU YS， ZHANG L， CHEN WS， 2015. Molecular cloning and expression analysis of cinnamic acid 4-hydroxylase gene from Isatis indigotica [J]. Chin Trad Herb Drugs， 46（1）：101-106. [胡永胜， 张磊， 陈万生， 2015. 菘蓝中肉桂酸-4-羟基化酶基因克隆与表达分析[J]. 中草药， 46（1）：101-106.]

KUMAR TK， TAMURA K， JAKOBSEN IB，et al， 2001. MEGA2：Molecular evolutionary genetics analysis software [J]. Bioinformation， 17：1244-1245.

LIANG L， HAN XX， ZHANG Z， et al， 2014. Cloning and expression analysis of cinnamate 4-hydroxylase （C4H） reductase gene from Aquilaria sinensis [J]. Chin Mat Med， 39（10）：1769-1771. [梁良， 韩晓敏， 张争， 等， 2014. 白木香肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）基因的克隆及表达分析 [J]. 中国中药杂志， 39（10）：1769-1771.]

LIAO H， ZHOU JY， 2008. Molecular cloning and analysis of a chalone synthase gene of Cassia tora [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 9：1728-1733. [廖海， 周嘉裕， 2008. 决明查尔酮合成酶基因的克隆及序列分析 [J]. 西北植物学报， 9：1728-1733.]

LINDA CQ， USHA RP， STEEVE TO， et al， 1986. Human cytochrome P-450 mRNA and gene：Part of a multigene family that contains Alu sequences in its Mrna [J]. Biochemistry， 83：6731-6735.

LUO XJ，LIU XC，YANG XY， et al， 2014. Cloning and tissue expression analysis of Hv C4H gene in Hulless barley [J]. Plant Genet Resourc， 15（3）：589-596. [羅小娇， 刘新春， 杨晓云， 等， 2014. 青稞C4H基因的克隆及组织表达分析 [J]. 植物遗传资源学报， 15（3）：589-596].

MA J， SU L， YUAN M， et al， 2012. Cloning and expression analysis of C4H and ANR genes in peanut （ Arachis hypogaea L.） [J]. Nucl Agric Sci， 26（1）：43-48. [马敬， 苏磊， 袁美， 等， 2012. 花生C4H和ANR基因的克隆与表达研究[J]. 核农学报， 26（1）：43-48.]

STEFAAN S，JASON K，YANO， et al， 2007. Adaptations for the oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons exhibited by the structure of Human P450 1A2 [J]. Biol Chem， 282（19）：14348-14355.

TAN GF， WANG F，WANG GL， et al， 2014. Ioslation and expression analysis of innamic Acid 4-hydroxylase gene under different tempertatures in Cryptotaenia japonica Hassk [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 34（7）：1298-1304. [谭国飞， 王枫， 王广龙， 等， 2014. 鸭儿芹肉桂酸4-羟化酶基因的克隆与不同温度下的表达分析 [J]. 西北植物学报， 34（7）：1298-1304.]

WOOLFE JA， 2008. Sweet potato：An untapped food resource [M]. Cambridge：Cambridge University Press：80-91.

WANG AN， WANG CC， WU L， et al， 2010. Soybean C4H gene clone and bioinformatics analysis [J]. J NE Agric Univ， 41（4）：12-15. [ 王安娜， 王婵婵， 吴蕾， 等， 2010. 大豆 C4H基因克隆及生物信息学分析 [J]. 东北农业大学学报， 41（4）：12-15.]

WILMOUTH RC， RUPERT C， TURNBULL， et al， 2002. Structure and mechanism of anthocyanidin synthase from Arabidopsis thaliana [J]. Structure， 1（10）：93-103.

XIAO SR，LI JD，2009. The natural anthocyanins of purple sweet potato [J]. Chin Food Nutr， 6：29-31. [肖素榮， 李京东， 2009. 新型天然色素——紫甘薯色素 [J]. 中国食物与营养， 6：29-31.]

ZHANG QT，FU YF， YANG CX， et al， 2004. The new species of purple sweet potato [J]. Bull Agric Sci Technol， 6：34. [张启堂， 付玉凡， 杨春贤， 等， 2004. 紫肉甘薯新品种——渝紫263 [J]. 农业科技通讯， 6：34.]

ZHANG HL，HUANG YS， YANG CX， et al， 2010. Molecular cloning and sequences analysis of flavanone 3-hydroxylase gene from Fagopyrum tataricum [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 30（3）：447-452. [张华玲， 黄元射， 杨春贤， 等， 2010. 苦荞黄烷酮3-羟化酶基因F3H的克隆及序列分析 [J]. 西北植物学报， 30（3）：447-452.]