山豆根地上部分的酪氨酸酶抑制活性成分筛选研究

阳丙媛， 何瑞杰， 王亚凤， 黄永林

( 广西植物功能物质与资源持续利用重点实验室， 广西壮族自治区中国科学院 广西植物研究所， 广西 桂林 541006 )

壮药山豆根，为豆科植物越南槐()的干燥根和根茎(王杰，2019)，主要分布于广西、云南、贵州等地(周思雨等，2021)，现收载于2020版中国药典，具有清热解毒，消肿利咽等功效，主治火毒蕴结、乳蛾喉痹、咽喉肿痛、齿龈肿痛、口舌生疮(中华人民共和国药典，2020)。经文献调研，对山豆根药用部位的化学成分和药理活性的研究报道较多，分离鉴定出的化合物主要包括生物碱类、黄酮类、三萜类、蒽醌类、酚酸类等(周思雨等，2021；魏鑫等，2021；Hou et al., 2020; 潘其明等，2016；李行诺等，2009)，相关的药理活性研究涉及抗肿瘤、抗炎、护肝等(周思雨等，2021)；而对其地上部分的相关研究却鲜有报道。山豆根作为常用中药材，一般3～4年才能采收(彭红华等，2014)，生长周期较长；山豆根的药用部位为其根和根茎，其地上部分被作为非药用部位丢弃，造成了资源的浪费；地上部分作为山豆根植株不可或缺的重要器官，对其次生代谢产物的产生、运输和储存具有重要意义。因此，探究其地上部分的化学物质基础和生物活性，对提高山豆根全植株的利用率具有重要意义。本研究以壮药山豆根的地上部分为研究对象，依托完善的天然产物开发研究平台，综合运用现代色谱分离手段、现代波谱学方法和现代药理学方法，拟探讨以下问题：(1)山豆根地上部分包含的化学成分有哪些；(2)山豆根地上部分含有的化学成分具有什么生物活性。

1 材料与方法

1.1 材料

山豆根的地上部分于2018年11月采自广西壮族自治区百色市那坡县，经广西大学的黄荣韶教授鉴定为越南槐()的地上部分，保存于广西植物功能物质与资源持续利用重点实验室，标本编号为20181103。

1.2 仪器和试剂

500 MHz核磁共振波谱仪(型号：Bruker Avance Ш HD；生产厂家：瑞士布鲁克公司)、高速逆流色谱仪(型号：TBE-300C；生产厂家：上海同田生物技术股份有限公司)、恒流泵(型号：TBP5002 TAUTO；生产厂家：上海同田生物技术股份有限公司)、恒温循环器(型号：TC-1050；生产厂家：上海同田生物技术股份有限公司)、紫外检测仪(型号：UV100；生产厂家：赛谱锐思科技有限公司)、真空离心浓缩仪(型号：QUC-23050-J00；生产厂家：英国Genevac公司)、系统控制器(型号：CBM-20A；生产厂家：日本岛津公司)、脱气机(型号：DGU-20A5；生产厂家：日本岛津公司)、高效液相色谱仪(型号：LC-20AT；生产厂家：日本岛津公司)、光电二极管阵列检测器(型号：SPD-M20A；生产厂家：日本岛津公司)、分析天平(型号：XS205 DualRange；生产厂家：瑞士苏黎世梅特勒-托利多集团)、电喷雾质谱(型号：BRUKER HCT；生产厂家：美国布鲁克道尔顿公司)、高分辨质谱(型号：LCMS-IT-TOF；生产厂家：日本岛津公司)、多功能荧光酶标仪(型号：SP-MAX3500FL；生产厂家：上海闪谱生物科技有限公司)。

甲醇(生产厂家：西陇化工股份有限公司)；20×PBS(生产厂家：北京索莱宝科技有限公司)；左旋多巴、曲酸和L-酪氨酸酶(生产厂家：上海源叶生物科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 提取与分离 山豆根地上部分(茎和叶)7.8 kg，切成小段后用70%乙醇浸泡提取3次，每次7 d，将提取液合并后减压浓缩至无醇味，再依次使用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将各萃取部分溶液旋干称重，分别得到石油醚部位浸膏(30 g)、乙酸乙酯部位浸膏(90 g)、水部位浸膏(400 g)。取乙酸乙酯部分浸膏经MCI gel CHP 20P(8.0 cm × 25.0 cm)柱层析，使用甲醇-水(0%～100%，)梯度洗脱，再经薄层色谱(TLC)检测合并得到7个组分FrB1-7。

FrB1(25.8 g)首先由C(5.0 cm × 16.0 cm)柱层析分离，甲醇-水(0%～100%，)梯度洗脱，经TLC检测，合并相同组分后得到亚组分FrB11-114。FrB13经反复Sephadex LH-20柱(2.0 cm × 25.0 cm)，以二氯甲烷-甲醇(1∶1，)为流动相，分离得化合物(6 mg)；FrB110经半制备型HPLC，以甲醇-水(86∶14，)洗脱，分离得化合物(6 mg)。FrB2(12.4 g)经Diaion HP20SS柱、Sephadex LH-20柱得到化合物(14 mg)。FrB3(9.8 g)经Sephadex LH-20柱层析、半制备型HPLC得到化合物(12 mg)和化合物(56 mg)。FrB4(6.5g)经Diaion HP20SS柱、Chromatorex C柱得到化合物(5 mg)和化合物(19 mg)。FrB6(13.7 g)由Sephadex LH-20、硅胶柱，纯化得到化合物(25 mg)、化合物(24 mg)、化合物(33 mg)。

1.3.2 酪氨酸酶抑制实验 酪氨酸酶的抑制活性测定参考已报道的方法(Takashi et al., 1997)，以磷酸缓冲液为溶剂，左旋多巴为底物(1 mg·mL)，曲酸为阳性对照，蘑菇酪氨酸酶配制成100 U·mL。实验分为4个组：样品组、样品背景对照组、空白组、空白对照组。

先向96孔板中依次加入样品溶液20 μL和酪氨酸酶溶液10 μL，每个样品孔均设置3个复孔做平行对照，混合均匀后置于37 ℃水浴中孵育10 min，接着加入40 μL的左旋多巴溶液，继续于37 ℃水浴中孵育5 min后，于475 nm波长下测定吸光度值，得到样品组吸光度值；以10 μL的磷酸缓冲液(PBS)替代10 μL的酪氨酸酶溶液，重复以上步骤，测得样品背景对照组吸光度值；以20 μL的PBS替代20 μL的样品溶液，测得空白组吸光度值；以30 μL的PBS替代20 μL的样品溶液和10 μL的酪氨酸酶溶液，测得空白对照组吸光度值。所有试验均重复3次。

按照如下公式计算酪氨酸酶抑制率，即：

抑制率= [1-(-)/(-)]×100%。

使用Statistical Product and Service Solutions软件处理，计算出相对应的IC值，试验数据结果以“平均值±标准偏差”表示。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

化合物白色粉末。HR-ESI-MS: 139.039 6 [M+H]。H-NMR (500 MHz, Acetone-): 7.88 (1H, dd,=7.8, 1.7 Hz, H-6), 7.50 (1H, dt,=7.8, 1.7 Hz, H-4), 6.96～6.86 (2H, m, H-3, 5);C-NMR (125 MHz, Acetone-): 172.5 (-COOH), 162.7 (C-2), 136.5 (C-4), 131.1 (C-6), 119.8 (C-5), 117.8 (C-1), 113.1 (C-3)。通过与文献(王丹等，2019)对比，确定化合物为水杨酸。

化合物白色针状结晶。HR-ESI-MS: 139.039 3 [M+H]。H-NMR (500 MHz, Acetone-): 7.90 (2H, d,=8.7 Hz, H-2, 6), 6.91 (2H, d,=8.7 Hz, H-3, 5);C-NMR (125 MHz, Acetone-): 167.7 (-COOH), 162.6 (C-4), 132.7 (C-2, 6), 122.6 (C-1), 115.9 (C-3, 5)。通过与文献(谢雪等，2016)对比，确定化合物为对羟基苯甲酸。

化合物黄色针晶。HR-ESI-MS m/z: 287.068 2 [M+H]。H-NMR (500 MHz, DMSO-): 12.94 (1H, s, 5-OH), 7.38～7.40 (2H, m, H-2′, 6′), 6.89 (1H, d,= 8.9 Hz, H-5′), 6.63 (1H, s, H-3), 6.43 (1H, d,=2.1 Hz, H-8), 6.18 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6)；C-NMR (125 MHz, DMSO-): 181.8 (C-4), 164.3 (C-2), 164.1 (C-9), 172.5 (C-7), 157.5 (C-5), 149.8 (C-3′), 145.9 (C-4′), 121.7 (C-6′), 119.1 (C-1′), 116.2 (C-5′), 113.5 (C-2′), 103.9 (C-3), 103.0 (C-10), 99.0 (C-6), 94.0 (C-8)。通过与文献(张艳丽等，2014)对比，确定化合物为木犀草素。

化合物黄色针晶。HR-ESI-MS: 355.119 7 [M+H]。H-NMR (500 MHz, Methanol-): 8.06 (2H, d,=8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.88 (2H, d,=8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.20 (1H, s, H-6), 5.30～5.08 (1H, m, H-2″), 3.45 (2H, d,=6.7 Hz, H-1″), 1.78 (3H, s, H-4″), 1.66 (3H, s, H-5″);C-NMR (125 MHz, Methanol-): 177.5 (C-4), 162.7 (C-7), 160.4 (C-5), 160.0 (C-4′), 155.4 (C-9), 147.9 (C-2), 136.9 (C-3), 132.4 (C-3″), 130.7 (C-2′, 6′), 124.1 (C-1′), 124.1 (C-2″), 116.3 (C-3′, 5′), 107.6 (C-8), 104.5 (C-10), 98.8 (C-6), 25.9 (C-4″), 22.5 (C-1″), 18.2 (C-5″)。通过与文献(杨瑞云等，2010)对比，确定化合物为8-异戊烯基山萘酚。

化合物黄色粉末。HR-ESI-MS: 303.025 4 [M+H]。H-NMR (500 MHz, Methanol-): 7.72 (1H, d,= 2.2 Hz, H-2′), 7.61 (1H, dd,= 8.5, 2.2 Hz, H-6′), 6.87 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5′), 6.37 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 6.17 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6);C-NMR (125 MHz, Methanol-): 177.3 (C-4), 165.7 (C-7), 162.4 (C-9), 158.2 (C-5), 148.8 (C-2), 148.0 (C-4′), 146.2 (C-3′), 137.2 (C-3), 124.2 (C-1′), 121.7 (C-6′), 116.2 (C-5′), 116.0 (C-2′), 104.5 (C-10), 99.3 (C-6), 94.5 (C-8)。通过与文献(王呈文等，2014)对比，确定化合物为槲皮素。

化合物白色粉末。HR-ESI-MS: 255.065 8 [M+H]。H-NMR (500 MHz, DMSO-): 8.17 (1H, s, H-2), 7.93 (1H, d,=8.8 Hz, H-5), 7.33 (2H, d,=8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (1H, m, H-8), 6.82 (1H, d,=2.7 Hz, H-6), 6.79 (2H, d,=8.5 Hz, H-3′, 5′);C-NMR (125 MHz, DMSO-): 175.4 (C-4), 162.9 (C-7), 157.9 (C-9), 157.5 (C-4′), 153.3 (C-2), 130.5 (C-2′, 6′), 128.6 (C-5), 124.0 (C-3), 123.0 (C-1′), 117.0 (C-10), 115.7 (C-3′, 5′), 115.5 (C-6), 102.5 (C-8)。通过与文献(周杰等，2013)对比，确定化合物为大豆素。

化合物淡黄色粉末。HR-ESI-MS: 431.134 5 [M+H]。H-NMR (500 MHz, DMSO-): 8.36 (1H, d,=6.5 Hz, H-2), 8.04 (1H, dd,=8.9, 2.1 Hz, H-5), 7.49 (2H, d,=8.7 Hz, H-2′, 6′), 7.21 (1H, d,=2.1 Hz, H-8), 7.15 (1H, dd,=8.9, 2.1 Hz, H-6), 6.97 (2H, d,=8.7 Hz, H-3′, 5′), 5.08 (1H, d,=7.1 Hz, H-1″), 3.76 (3H, s, 4′-OCH)；C-NMR (125 MHz, DMSO-): 175.2 (C-4), 161.7 (C-7), 159.4 (C-4′), 157.4 (C-9), 153.9 (C-2), 130.3 (C-2′, 6′), 127.3 (C-5), 124.1 (C-1′), 123.8 (C-3), 118.8 (C-10), 116.0 (C-6), 114.0 (C-3′,5′), 103.8 (C-8), 100.3 (C-1″), 77.4 (C-5″), 76.6 (C-3″), 73.4 (C-2″), 70.1 (C-4″), 61.0 (C-6″), 55.5 (4′-OCH)。通过与文献(郑善松等，2011)对比，确定化学物为芒柄花素-7---D-葡萄糖苷。

化合物黄色针晶。HR-ESI-MS: 269.046 5 [M+H]。H-NMR (500 MHz, DMSO-): 8.32 (1H, s, H-2), 7.97 (1H, d,=8.8 Hz, H-5), 7.50 (2H, d,=8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.98 (2H, d,=8.8 Hz, H-3′, 5′), 6.94 (1H, dd,=8.8, 2.3 Hz, H-6), 6.87 (1H, d,=2.3 Hz, H-8), 3.78 (3H, s, OCH);C NMR (125 MHz, DMSO-): 174.7 (C-4), 162.6 (C-7), 159.0 (C-4′), 157.5 (C-9), 153.1 (C-2)，130.1 (C-2′, 6′)，127.3 (C-5), 124.3 (C-1′)，123.2 (C-3), 116.6 (C-10), 115.2 (C-6), 113.7 (C-3′, 5′), 102.1 (C-8), 55.3 (4′-OCH)。通过与文献(毕丹等，2018)对比，确定化合物为刺芒柄花素。

化合物白色针晶。HR-ESI-MS: 301.071 0 [M+H]。H-NMR (500 MHz, Methanol-): 8.05 (1H, s, H-2), 7.37 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2′, 6′), 6.84 (2H, d,= 7.5 Hz, H-3′, 5′), 6.44 (1H, s, H-8), 3.87 (3H, s, 6-OCH);C-NMR (125 MHz, Methanol-): 182.5 (C-4), 158.9 (C-5), 158.7 (C-4′), 155.0 (C-7), 154.8 (C-9), 154.6 (C-2), 132.9 (C-6), 131.4 (C-2′, 6′), 124.2 (C-1′),123.3 (C-3), 116.3 (C-3′, 5′)，106.7 (C-10), 95.0 (C-8), 60.9 (6-OCH)。通过与文献(邱鹰昆等，2006)对比，确定化合物为鸢尾黄素。

化合物淡黄色针状结晶。HR-ESI-MS: 271.060 8 [M+H]。H-NMR (500 MHz, DMSO-): 12.94 (1H, s, OH-5), 8.26 (1H, s, H-2), 7.33 (2H, d,= 8.6 Hz, H-2′, H-6′), 6.84 (2H, d,= 8.6 Hz, H-3′, H-5′), 6.36 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 6.21 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6);C-NMR (125 MHz, DMSO-): 180.3 (C-4), 164.3 (C-7), 162.1 (C-4′), 157.7 (C-5), 157.5 (C-9), 153.9 (C-2), 130.2 (C-2′, 6′), 122.4 (C-1′), 121.3 (C-3), 115.2 (C-3′, 5′), 104.6 (C-10), 99.0 (C-6), 93.7 (C-8)。通过与文献(向槿等，2020)对比，确定化合物为金雀异黄素。

2.2 酪氨酸酶抑制活性测试结果

以“1.3.2”所述方法测定化合物、和的酪氨酸酶抑制活性，测试结果见表1。结果显示，与阳性对照相比，化合物表现出较强的酪氨酸酶抑制活性，IC值为(1.58±0.31)×10mol·L；化合物对酪氨酸酶的抑制作用与阳性对照相当；化合物对酪氨酸酶的抑制作用稍弱于阳性对照。

表 1 酪氨酸酶抑制活性的测试结果Table1 Results of tyrosinase inhibitory activity

3 讨论与结论

研究显示，一些中药的非药用部位与其药用部位具有相似的化学成分和疗效，可作为替代药物入药。例如，补益药人参的传统药用部位为干燥根和根茎，而其非药用部位叶因含有相同的有效成分人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，同样具有补气生津的功效，已被收载于中国药典(中华人民共和国药典，2020)。一些中药的非药用部位与其药用部位具有不同化学成分和生物活性，可为药物研发提供基础研究支持。例如，活血化瘀药西红花的传统药用部位为干燥柱头，有效成分为西红花苷，而其非药用部位含有黄酮、多酚、皂苷、生物碱等多种化学成分，具有抗炎、抗氧化、降血压和保肝等作用(陈娜和杨滨，2018)。一些中药的非药用部位可用于制造化妆品、食品、兽药等(赵晖和苗明三，2019)。由此可见，中药的非药用部位具有巨大的开发潜力和应用前景；同时，利用好非药用部位，能避免药材资源的浪费，有利于实现中药资源的可持续发展。具有清热解毒功效的山豆根，其药用部位为根和根茎，有效成分为苦参碱和氧化苦参碱(中华人民共和国药典，2020)，而本研究首次阐明了山豆根地上部分含有黄酮类和酚酸类化合物，并发现这类化合物具有较好的酪氨酸酶抑制活性，是潜在的酪氨酸酶抑制剂。以上研究结果揭示了山豆根地上部分的化学物质基础及其生物活性，为进一步开发利用山豆根的非药用部位提供了科学依据。