罗汉果苷IIE在巨噬细胞糖尿病炎症模型中的作用

黄 凯, 肖 娟, 李爱丽

( 1. 广西肝脏损伤与修复分子医学重点实验室， 桂林医学院附属医院， 广西 桂林 541001； 2. 桂林医学院附属医院， 广西 桂林 541001 )

罗汉果 () 是我国广西特有的传统药食同源植物，属于葫芦科家族成员。经检测，罗汉果内富含蛋白质、维生素、微量元素、多糖等营养成分，同时含有葫芦烷三萜皂苷和黄酮等多种活性成分，其中葫芦烷三萜化合物为罗汉果主要功能成分。现代药理研究证实，罗汉果不仅具有止咳祛痰、抗氧化、抗炎等药理作用，而且能显著干预糖脂代谢异常。有研究发现，给患有糖尿病的小鼠服用罗汉果苷，可以预防和减少糖尿病并发症 (Song et al., 2007；Suzuki et al., 2007；Qi et al.,2008)。罗汉果苷IIE既是一种苦味三萜皂苷，也是罗汉果苷V的前体，为未成熟罗汉果的主要成分。然而，罗汉果苷IIE在糖尿病治疗当中的作用，至今仍然未知。

有研究表明，巨噬细胞不仅在宿主防御机制中发挥关键作用，而且在促炎细胞因子和细菌LPS暴露下被激活 (Xie et al.,1993；Zhang & Ghosh, 2000)。被诱导的巨噬细胞大量产生促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6和NO、PGE2等。这些促炎因子在炎症性疾病中发挥关键作用 (Vane et al., 1994；Marks-Konczalik et al., 1998)。由于血浆中丰富的脂肪酸棕榈酸(PA)的增加可导致II型糖尿病的血脂异常，表明PA是一种重要的参与糖尿病的脂肪酸。同时，临床研究报道在肥胖患者血液循环中脂多糖(LPS)升高，进而LPS可通过TLR4信号通路触发炎症反应，激活组织炎症因子。综上认为，糖尿病合并肥胖患者可能同时存在PA升高和LPS升高。 因此，本文采用LPS和PA联合处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7构建糖尿病炎症模型，该模型的建立能客观地模拟糖尿患者体内因PA和LPS失调而引起的炎症反应，同时能简便、节约、快速、客观地观察实验结果，具有一定的创新性。随后，我们在该糖尿病模型的基础上研究罗汉果苷IIE对细胞内炎症因子TNF-α mRNA的影响，旨在探索罗汉果苷IIE治疗糖尿病的潜在可能性，为糖尿病治疗新策略的提出提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

棕榈酸(PA)、脂多糖(LPS)均购自Sigma公司；罗汉果苷IIE购自成都曼斯特生物科技有限公司(http://www.cdmust.com/)，并溶于甲醇配置成20 μmol·L溶液。

1.2 PA母液的配置

将一定量的PA加入含0.1 mol·LNaOH的70%乙醇中，用70 ℃水浴溶解 ，混匀后冷却至室温，待用。

1.3 细胞培养

小鼠巨噬细胞RAW 264.7购自上海生命科学研究院细胞资源中心，细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM(购自Gibco公司)完全培养基中，置于37 ℃、5% CO的饱和湿度培养箱中培养。

1.4 qRT-PCR检测加药后细胞内炎症因子TNF-α mRNA表达水平的变化

收集各组加药后24 h生长状态良好的RAW 264.7细胞，采用Trizol 法提取细胞中总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，采用SYBR Green Gene Expression Assay试剂盒分别检测转染后各组细胞中TNF-α和内参GAPDH mRNA的表达。本研究采用40个循环，扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s 。扩增结束后统计各组CT值，采用相对定量2计算各组RAW 264.7细胞内炎症因子TNF-α mRNA相对表达水平。TNF-α引物序列为F: 5′-CTT CAG GGA TAT GTG ATG GAC TC-3′，R: 5′-GGA GAC CTC TGG GGA GAT GT-3′；GAPDH的引物序列为F: 5′-GGTGCTGAGTATGTCGTG-3′，R: 5′-TTCAGCTCTGGGATGACC-3′。

1.5 统计学分析

2 结果与分析

2.1 LPS和PA诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7后细胞内炎症因子TNF-α mRNA表达水平的变化

本研究的实验部分可以分为4个组，即未处理组(NC)、PA单独诱导组、LPS单独诱导组以及PA和LPS联合诱导组。经上述处理后，分别于0、1、3、6、12、24 h六个不同时间点收集细胞，并采用qRT-PCR检测细胞内炎症因子TNF-α mRNA表达水平的变化。由图1可知，1 ng·μL的LPS诱导产生的细胞内炎症因子TNF-α mRNA表达水平在1、3、6、12 h时间点均显著高于未处理组(NC)的，差异具有统计学意义(<0.05)；100 μmol·L的PA诱导产生的炎症因子TNF-α mRNA表达水平在1、3、6、12、24 h时间点均与未处理组(NC)无显著差异(>0.05)；经LPS和PA联合诱导后的细胞内炎症因子TNF-α mRNA表达水平在1、6、24 h时间点均显著高于LPS、PA的单独诱导组，差异具有统计学意义(<0.05)，且在24 h时间点差异最显著，这说明1 ng·μL的LPS和100 μmol·L的PA联合诱导RAW 264.7细胞在24 h时间点产生的协同作用最佳。因此，我们将24 h作为LPS和PA联合处理的最佳诱导时间。

图 1 LPS和PA诱导小鼠巨噬细胞后各组细胞中炎症因子TNF-α mRNA表达水平随时间的变化情况Fig. 1 Changes of inflammatory factor TNF-α mRNA expression levels with time in each group mouse macrophages induced by LPS and PA

2.2 LPS和PA诱导24 h后小鼠巨噬细胞RAW 264.7的变化

从图2可以看出，小鼠巨噬细胞RAW 264.7经LPS和PA分别单独诱导以及LPS和PA联合诱导24 h后小鼠巨噬细胞发生变化。图2结果显示，LPS+PA联合诱导组的细胞数最少且含有少量的死细胞，而LPS诱导组的细胞数最多，进一步说明1 ng·μL的LPS和100 μmol·L的PA两者共同处理小鼠巨噬细胞24 h后产生的炎症协同作用最好。因此，选用24 h 为LPS和PA联合诱导的最佳时间。

A. 未处理组; B. 棕榈酸; C. 脂多糖; D. 棕榈酸+脂多糖。图中标尺均为200 μm。A. Negative control; B. Palmitic acid; C. Lipopolysaccharide; D. Palmitic acid + Lipopolysaccharide. All scale bars are 200 μm.图 2 LPS和PA诱导小鼠巨噬细胞24 h后小鼠巨噬细胞的变化情况Fig. 2 Changes of mouse macrophages induced by LPS and PA for 24 h

2.3 罗汉果苷IIE可以有效抵制LPS和PA联合诱导产生的炎症协同作用

应用qRT-PCR分别检测0、1、3、6、12、24 h六个不同时间点细胞中炎症因子TNF-α mRNA的表达水平(图3)。图3结果显示，20 μmol·L的罗汉果苷 IIE处理12 h可以显著降低LPS和PA联合诱导生成的炎症因子TNF-α mRNA表达水平，差异具有统计学意义(<0.05)；对由LPS或PA单独诱导产生的TNF-α mRNA表达水平无显著差异(>0.05)。这说明罗汉果苷IIE可以抑制LPS(1 ng·μL)和PA(100 μmol·L)联合诱导产生细胞炎症反应，从而有效降低巨噬细胞的炎症水平。

图 3 罗汉果苷IIE处理经PA和LPS单独或联合诱导的小鼠巨噬细胞12 h后各组细胞中炎症因子TNF-α mRNA表达水平的变化Fig. 3 Changes of inflammatory factor TNF-α mRNA expression levels in mouse macrophages induced by PA and LPS alone or in combination with mogroside IIE for 12 h in each group

3 讨论与结论

糖尿病炎症的调控对糖尿病的治疗至关重要。Guariguata等 (2014)研究表明，糖尿病是一种复杂的以高血糖为特征的代谢性疾病， 严重影响患者的生活质量。Wellen等(2005)研究表明，该代谢性疾病与炎症的异常产生和炎症信号通路的激活密切相关。本研究用小鼠巨噬细胞来模拟糖尿病炎症模型时的LPS和PA所选浓度与Xiao等(2020)所报道的一致，我们的实验结果也显示在该浓度下两者共同作用可诱导炎症协同效应。同时，在糖尿病病人的体内，炎症反应可以对人体细胞造成一定的伤害，说明所选浓度具有可行性。

本课题组肖娟博士2020年发表的文章结果发现，20 μmol·L的罗汉果苷在细胞模型和小鼠中可通过下调IL-9/IL-9受体通路改善胰腺炎(Xiao et al., 2020)，并且由于本研究涉及的分组比较多，因此在采用罗汉果苷IIE处理小鼠巨噬细胞炎症模型时，我们只检测了不同时间点LPS和PA联合诱导生成的炎症因子TNF-α mRNA表达水平的变化。本研究结果发现，处理12 h的效果最佳，用20 μmol·L的罗汉果苷IIE处理12 h能够显著降低细胞内PA和LPS联合诱导的协同炎症反应，而对PA或LPS单独诱导的炎症反应无显著作用。但是，此具体作用机制目前还不甚清楚，有待进一步深入研究。

罗汉果苷IIE是从可食用的罗汉果果实中提取而来，且罗汉果中的糖类在人体内升糖作用弱。基于这一点，罗汉果苷IIE可以成为糖尿病病人辅助治疗的一个重要方向。因此，本研究结果将对开发有效的抗糖尿病炎症药物以及改善糖尿病患者的生活质量具有重要的指导意义。另外，由于罗汉果苷IIE为未成熟罗汉果中含量最高的苷类，且每年丰收季节未成熟的罗汉果占有一定的比例，因此本研究结果既有助于提高未成熟罗汉果的利用价值，又有利于提升成熟罗汉果的经济价值。