pH区带精制逆流色谱法分离制备越南槐中具有抑制α-糖苷酶活性的生物碱

梁森林， 黄永林， 何瑞杰， 王亚凤， 阳丙媛， 李典鹏， 司红彬

( 1. 广西大学 动物科学技术学院， 南宁 530005； 2. 广西植物功能物质与资源持续利用重点实验室， 广西壮族自治区中国科学院 广西植物研究所， 广西 桂林 541006 )

山豆根为豆科植物越南槐()干燥的根和根茎(陈兴广等, 2020)，主要分布于广西、云南、贵州等地(中华人民共和国药典，2010)，具有清热解毒、消肿利咽的功效，用于治疗胃部、牙龈、咽部、肺部等部位的炎症(Hou et al., 2020)。山豆根药材中的生物碱具有毒性(田雪松, 2016)，也有抗炎(Ding et al., 2006)、抗病毒(戴五好等, 2012)、抑菌(He et al., 2019)等多种生物活性，其中苦参碱和氧化苦参碱(李丰等, 2020)等喹诺里西啶类生物碱为主要的生物碱成分(陈影等, 2017)。由于山豆根生长环境较为特殊，家种栽培模式尚处于探索阶段，近年来山豆根产量下滑趋势明显，而越南槐的地上部分作为山豆根非药用部位富含生物碱，但尚未得到开发利用。因此，为了提高药用植物的利用率，创建快速分离制备山豆根非药用部位中的生物碱的方法显得尤为必要。

高速逆流色谱(HSCCC)是近数十年发展起来的液-液分配色谱(步知思等, 2018)，具有无柱污染、无不可逆吸附、进样量大，同一根逆流色谱柱既可用于分析，也可用于制备等的优点(刘倩, 2016)。pH区逆流色谱由高速逆流色谱发展而来，利用待分离物质的酸碱解离常数和疏水性的不同进行分离，目前被广泛应用于离子型化合物如有机酸(徐敏和修彦凤, 2016)、生物碱(马涛等, 2014)等的分离。本研究利用pH区带精制逆流色谱法对越南槐地上部分总生物碱进行分离制备，共得到两个高纯度的生物碱化合物：苦参碱和氧化苦参碱(化学结构见图1)。该方法简单，高效，分离纯度高。

图 1 苦参碱和氧化苦参碱的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of matrine and oxymatrine

随着生活水平的提高，糖尿病这一代谢性疾病的发病率逐年升高，对糖尿病的研究也因此成为中内外学者近年来所关注的热点(宋彤彤等, 2019)。本研究也报道了越南槐地上部分总提取物、总生物碱及分离得到的两个生物碱的-葡萄糖苷酶抑制活性。

1 仪器与材料

TBE-300C高速逆流色谱仪(上海同田生物技术股份有限公司)、TBP5002 TAUTO恒流泵(上海同田生物技术股份有限公司)、UV100紫外检测器(赛谱锐思科技有限公司)、GeneVac miVac真空离心浓缩仪(英国GeneVac公司)、TC-1050恒温循环器(上海同田生物技术股份有限公司)、CBM-20A系统控制器(日本岛津公司)、DGU-20A5脱气机(日本岛津公司)、LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)、Brucker Avance Ш HD-500 MHz超导核磁共振波谱仪(瑞士，Brucker公司)、SPD-M20A光电二极管阵列检测器(日本岛津公司)、XS205 DualRange(瑞士苏黎世的梅特勒-托利多集团)分析天平、BRUKER HCT电喷雾质谱(美国，布鲁克道尔顿公司)和MAT 95XP高分辨质谱 (美国，Thermo)、ADP440+ 旋光计(德国，优莱博有限公司)、OSB-2100油浴锅(上海爱朗仪器有限公司)、SP-MAX3500FL多功能荧光酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)。

阿卡波糖、-葡萄糖苷酶、对硝基苯酚--D-吡喃葡萄糖苷均购自上海源叶生物科技有限公司；20×PBS(北京索莱宝科技有限公司)；无水碳酸钠、乙腈、二氯甲烷、甲醇(西陇化工股份有限公司，分析纯)；HPLC分析用水为实验室自制超纯水。

越南槐()的地上部分于2018年11月采自广西百色市那坡县，由广西大学黄荣韶教授鉴定，标本(编号：20181103)保存于广西植物功能物质与资源持续利用重点实验室。

2 实验方法

2.1 越南槐的地上部分总生物碱的制备

取越南槐的地上部分干燥的茎叶1 kg，粉碎后用95%乙醇浸泡一周，将滤液浓缩旋干得浸膏，取部分浸膏用HCl调pH至3，离心后将上清液减压旋干后用适量水溶解过AB-8大孔树脂柱，顺次加入水，20%氨水，70%甲醇-水进行洗脱，收集70%甲醇-水洗脱馏分，旋干即得到总生物碱。

2.2 样品溶剂系统及样品溶液的制备

2.2.1 样品溶剂系统的制备 选取二氯甲烷-甲醇-水(5∶3∶2，)为溶剂系统进行试验，量取1 000 mL二氯甲烷、600 mL甲醇、400 mL水置于分液漏斗中，剧烈震荡后静置半小时，取出下相和上相，在上相中加入HCl (10 mmol·L) 0.344 mL 作为固定相，在下相中加入TEA (10 mmol·L) 0.444 mL作为流动相，超声脱气30 min后备用。

2.2.2 样品溶液的制备 取1.2 g总生物碱放于试管中，加入7.5 mL含有HCl的上相和7.5 mL未添加TEA的下相，超声震荡使其充分溶解，准备用于pH区带逆流色谱分离。

2.3 分离及鉴定

2.3.1 pH区带逆流色谱分离过程 将超声脱气过的上相以20 mL·min的速度泵入高速逆流主机中作为固定相使用，15 min后观察到出口有液体流出，说明固定相已完全充满螺旋管。样品溶液用等量的已加入酸的上相和未加入碱的下相溶解，在load模式中将样品溶液注入进样环，旋转进样口旋钮至inject档位，将主机旋转方向调为顺时针后，慢慢调节主机转速至850 r·min，待转速稳定后，以2 mL·min的速度泵入流动相，同时开启紫外检测器及记录仪，设置紫外检测波长为210 nm，通过观察色谱图的出峰情况手动收集馏分，分离完成后，将主机内液体用压缩空气吹出，使用500 mL量筒收集并计算固定相保留率。

2.3.2 HPLC分析 用HPLC分析越南槐地上部分生物碱粗提物和分离后的各组分。液相色谱柱为Eclipse XDB-C(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸水(5∶95)，进样量为20 μL；流速设定为0.8 mL·min；检测波长为210 nm，柱温为室温。

对pH区带逆流色谱分离到的结构采用高分辨质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱分析进行鉴定。

2.3.3 化合物结构鉴定

化合物白色粉末，(+)HR-ESI-MS: 249.196 67 [M+H](计算相对分子质量为249.196 62)，其对应的分子式为CHNO。H NMR (500 MHz，CDCl)δ: 4.38 (1H, dd,= 12.5, 4.1 Hz, H-17e), 3.80 (1H, dt,= 9.5, 6.1 Hz, 11-H), 3.03 (1H, t,= 12.5 Hz, H-17a), 2.80 (2H, d,=11.6 Hz, H-10e, H-2e), 2.41 (1H, dt,= 17.0, 4.1 Hz, H-14e), 2.23 (1H, m, H-14a), 2.07 (2H, m), 1.90 (3H, m), 1.79 (1H, m, H-9a), 1.73～1.34 (11H, m)。C NMR(125 MHz，CDCl)δ: 165.98 (C-15), 63.93 (C-6), 57.43 (C-2), 57.36 (C-10), 43.37 (C-17), 41.60 (C-7), 35.49 (C-5), 32.97 (C-14), 27.90 (C-12), 27.28 (C-4), 26.60 (C-8), 21.32 (C-3), 20.91 (C-9), 19.11 (C-13)。将数据与文献(董刘宏等，2010)比较，确定其为苦参碱。

化合物无色粉末，(+)HR-ESI-MS: 265.191 61 [M+H](计算相对分子质量265.191 60)，其对应的分子式为CHNO。H NMR (500 MHz，CDCl): 5.07 (1H, dt,= 10.4, 6.1 Hz, H-11), 4.38 (1H, dd,= 12.0, 5.2 Hz, H-17e), 4.15(1H, t,= 12.0, H-17a), 3.07 (5H, m), 2.64 (2H, m), 2.42 (1H, m, H-14e), 2.20(2H, m, H-14a, H-12e), 2.02 (1H, m, H-8e), 1.85～1.50 (9H, m), 1.23 (1H, m, H-12a)。C NMR(125 MHz, CDCl): 170.26 (C-15), 69.67 (C-10), 69.32 (C-2), 67.32 (C-6), 53.10 (C-11), 42.86 (C-7), 41.84 (C-17), 34.71 (C-5), 33.05 (C-14), 28.67 (C-12), 26.29 (C-4), 24.85 (C-8), 18.78 (C-13), 17.37 (C-3), 17.32 (C-9)。将数据与文献(郭依俐和刘庆，2019)比较，确定其为氧化苦参碱。

2.4 阿卡波糖IC50值的测定

2.4.1 PBS溶液的配制 将20×PBS溶液用蒸馏水稀释20倍即得。

2.4.2 1 U·mL-葡萄糖苷酶溶液的配制 准确称取1 mg-葡萄糖苷酶，溶于25.4 mL PBS中，现配现用。

2.4.3 1 mmol·LPNPG溶液的配制 称取3 mg PNPG加入10 mL PBS溶液中超声溶解，现配现用。

2.4.4 0.2 mol·LNaCO溶液配制 称取2.16 g NaCO于烧杯中，加蒸馏水定容至100 mL。

2.4.5 实验步骤 采用PNPG法进行测定(李古月等，2015)，反应在96孔板中进行，按照顺序加入50 μL PBS缓冲液，20 μL不同浓度的阿卡波糖溶液，10 μL-葡萄糖苷酶溶液，置于37 ℃油浴锅中预热5 min，然后加入20 μL PNPG溶液，于37 ℃油浴锅中继续加热25 min后取出，加入50 μL NaCO终止反应。实验平行3次，于波长405 nm处测定吸光度。通过Statistical Product and Service Solutions软件计算出其IC值。

将待测样品代替阿卡波糖按照上述步骤操作，得到待测样品IC值。实验平行3次，将测得结果与阳性对照品阿卡波糖的IC值对比。

-葡萄糖苷酶抑制率公式：

抑制率= [1-(-/-)]×100%。

式中：、、、分别代表405 nm下测得的样品组、背景组、阴性对照组、空白对照组的吸光值。

表 1 α-葡萄糖苷酶反应体系 (单位： μL)Table 1 α-glucosidase reaction system (Unit： μL)

3 结果与分析

3.1 HPLC的条件优化

实验优化了液相色谱条件以确保各组分达到基线分离，对流动相：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1% TEA水、乙腈-0.1% TEA水、甲醇-0.1% 磷酸水、乙腈-0.1% 磷酸水的分离效果进行了比较，结果显示，当选用乙腈-0.1% 磷酸水(5∶95)作为流动相，流速为0.8 mL·min时，越南槐地上部分总生物碱中各成分能实现基线分离，分离效果见图2。

1. 苦参碱; 2. 氧化苦参碱。1. Matrine; 2. Oxymatrine.图 2 总生物碱的HPLC色谱图Fig. 2 HPLC chromatogram of total alkaloids

3.2 pH区带精制逆流色谱色谱条件的优化

在分离生物碱的经典pH区带精制逆流色谱正向置换模式下，总生物碱中的各类化合物依据其解离常数及疏水性不同，在保留酸的前方形成一系列的溶质区带，达到平衡后，每个溶质区带和保留酸以相同的速率移动。以本实验为例，固定相水相位于管道的上半部分，有机流动相位于下半部分，保留酸形成了一个陡峭的边界，如图3所示，在边界右侧，碱性待分离物质从保留酸中获得质子并进入固定相中(位置④)，当保留酸边界向前推移时，溶质正离子被置于高pH值范围内(位置①)，被夺去质子后回到疏水性的非离子形式迅速进入流动相中(位置②)，溶质穿过边界后重新置于低pH值范围内(位置③)，获得质子而回到固定相中(位置④)，这一过程不断重复直至保留碱流出色谱柱。会出现具有最小重叠的矩形平台峰(Cai et al.，2020)，物质被高度浓缩在平台内(Tong et al.，2013)而杂质被有效祛除并集中在平台两侧(Wang et al.，2012)。本实验首先使用了二氯甲烷-甲醇-水(5∶3∶2，)(上相加入10 mmol·LHCl,下相加入10 mmol·LTEA)为溶剂系统对总生物碱进行pH区带精制逆流色谱分离，其结果如图4：A所示， 49～98 min馏分经HPLC检测为化合物，162～178 min馏分为化合物，但化合物中夹杂有化合物，未能实现完全分离。由于待分离物质的解离常数在一定的条件下为常数，其解离程度主要由保留酸决定。调整保留酸的浓度，会导致矩形峰的宽度及出峰时间发生改变。因此，为了获得更好的洗脱效果，加20 mmol·LHCl于固定相中，流动相中TEA的浓度不变，用pH区带精制逆流色谱分离总生物碱的效果如图4：B所示，68～113 min出现了化合物，148～200 min出现了化合物，经HPLC分析，其纯度分别为98.7%和98.2%。

图 3 pH区带精制逆流色谱分离原理图Fig. 3 Schematic figure of PZRCCC separation principle

1. 苦参碱; 2. 氧化苦参碱。溶剂系统: 二氯甲烷-甲醇-水 (5∶3∶2, V/V)。A. 上相添加10 mmol·L-1盐酸，下相添加10 mmol·L-1三乙胺； B. 上相添加20 mmol·L-1盐酸，下相添加10 mmol·L-1三乙胺。1. Matrine; 2. Oxymatrine. Solvent system: CH2Cl2 -MeOH-H2O (5∶3∶2, V/V). A. 10 mmol·L-1 HCl in upper phase and 10 mmol·L-1 TEA in lower phase; B. 20 mmol·L-1 HCl in upper phase and 10 mmol·L-1 TEA in lower phase.图 4 越南槐的地上部分生物碱pH区带精制逆流色谱Fig. 4 PZRCCC of total alkaloids from the aerial part of Sophora tonkinensis

3.3 样品对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

以样品浓度和抑制率作图，求得各样品的IC值如表2所示。结果表明，越南槐地上部分总提取物及总生物碱对-葡萄糖苷酶抑制作用微弱，而苦参碱和氧化苦参碱均对-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性，且氧化苦参碱的抑制作用明显强于苦参碱。

表 2 样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 2 α-glucosidase inhibitory activity of samples

4 讨论与结论

生物碱是天然产物中药理活性较好和成药性较高的一类化合物，对这类化合物使用传统的柱色谱法往往存在拖尾严重和收率低的问题，因此生物碱的分离一直是分离科学与技术领域中的一个研究热点和难点问题。pH区带精制逆流色谱法是近年来由高速逆流色谱的基础上发展而来一种分离方法，由于其依据物质的解离常数(pKa)和疏水性的不同而实现分离。本实验以选定的二氯甲烷-甲醇-水为溶剂系统，采用化学手段，根据待分离样品的酸碱特性，通过增加上层水相中HCl浓度、下层有机相中TEA浓度保持不变，使样品的色谱分离过程呈现按pH区带聚集的特征，组分的洗脱过程变成了类似置换色谱的洗脱过程，其色谱图为按pH值的大小排列的边界陡峭的矩形峰，同时杂质被集中在峰的两侧，其结果是分离容量增大、分离效率提高。因此，pH区带精制逆流色谱法目前广泛用于生物碱、有机酸的制备性分离。然而，溶剂系统的选择是一大难点，一个合适的溶剂系统往往需要经过较长时间的摸索，而且是决定试验成败的关键因素。本研究利用pH区带精制逆流色谱法从山豆根非药用部位中快速高效地分离制备苦参碱及氧化苦参碱，为其他生物碱的分离制备提供了参考。-葡萄糖苷酶抑制活性实验结果显示总提物的最大抑制率数倍于总生物碱的最大抑制率，提示总提取物中可能含抑制活性更强的成分，这些成分有待进一步的挖掘。同时，越南槐的茎叶作为中药——山豆根的一个副产物, 资源丰富，富含苦参碱和氧化苦参碱等生物碱成分，开发潜力巨大，能否成为山豆根替代资源仍亟待进一步的研究。