猫须草抗炎活性成分研究

李毅鹏， 潘争红， 符毓夏， 宁德生*， 李连春， 海 洪

( 1. 桂林理工大学 化学与生物工程学院， 广西 桂林 541006； 2. 广西植物功能物质与资源持续利用重点实验室， 广西壮族自治区中国科学院 广西植物研究所， 广西 桂林 541006 )

猫须草()为唇形科肾茶属多年生草本植物，因其雄蕊酷似猫须，又名“肾茶”“猫须公”，傣名“雅糯妙”，是傣族传统的药食两用植物(国家中医药管理管《中华本草》编委会，2005)。猫须草含有丰富的黄酮、酚酸、萜类、木脂素等成分(张永怡等，2021)，而且药理学研究显示该植物具有清热利水，排石通淋的功效，通常用于治疗急慢性肾炎和痛风等疾病，表明猫须草对炎症性疾病具有较好疗效(刘少会等，2017；谢招虎等，2019；郭银雪等，2020)。目前，有关猫须草的文献报道多侧重于提取物活性筛选及其提取工艺研究，抗炎活性物质基础研究较少。为了阐明该药用植物的抗炎活性成分，本实验采用活性追踪的方法，对猫须草抗炎活性部位进行化学成分研究。结果从活性部位中分离得到10个化合物(图1)，其中化合物、、-为首次从该植物中分离得到，通过体外抗炎活性筛选，明确该植物抗炎作用的活性部位及其物质基础。本研究结果可为猫须草的开发利用提供科学依据。

图 1 化合物1-10结构式Fig. 1 Structures of compounds 1-10

1 材料与仪器

1.1 材料

猫须草采自广东罗定市龙湾镇，经广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所蒋运生研究员鉴定为唇形科肾茶属植物猫须草()的全草。凭证样品存放于广西植物功能物质与资源持续利用重点实验室。

细胞株：RAW 264.7细胞(中国典型培养物保藏中心)。

1.2 仪器

500 MHz超导核磁共振波谱仪(瑞士 布鲁克公司)；LC-MS-IT-TOF液相色谱质谱联用仪(日本岛津公司)；安捷伦 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；XS205型精密分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；倒置显微镜(舜宇光学科技有限公司)；无菌操作台(苏净集团苏州安泰有限公司)；全波长多功能酶标仪(Bio Tek公司)；二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo公司)。

1.3 试剂

DMEM营养液和胎牛血清(ThermoFisher Scietific公司)；NO试剂盒(RnD Systems公司)；LPS(Sigma公司)；柱色谱和薄层色谱所用硅胶(青岛海洋化工有限公司)； MCI填料(日本三菱化学公司)；Sephadex LH-20凝胶(Amershan Biosciences 公司)；色谱纯乙腈(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；甲醇、95%乙醇、石油醚等试剂均为分析纯(西陇化工股份有限公司)。

2 实验方法

2.1 提取和分离

猫须草全草，阴干粉碎，称取15.0 kg粗粉，加入95%乙醇浸提3次(45 L×3)，每次提取24 h，过滤，合并3次浸提液，50 ℃减压回收溶液，得到浸膏162.5 g。取150 g浸膏用适量纯水超声溶解， 分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到相应的提取物。对不同极性提取物进行体外抗炎试验。根据抗炎活性和TLC分析结果，将石油醚和乙酸乙酯部位合并，过MCI柱纯化，依次用体积分数为20%、40%、60%、80%、95%的甲醇梯度洗脱，收集各流分，50 ℃减压浓缩，得到5个组分：20%(11.4 g)、40%(8.8 g)、60%(19.7 g)、80%(21.4 g)、95%(15.3 g)。

根据TLC分析结果，将60%和80%组分合并，过硅胶柱分离纯化，用石油醚/乙酸乙酯(10∶1→0∶1，)洗脱，得到5个组分Fr.1～Fr.5。Fr.1 过硅胶柱纯化，用石油醚/乙酸乙酯(5∶1→0∶1，)洗脱，经TLC检视合并各流分，得到3个组分Fr.1-1～Fr.1-3。Fr.1-2 经硅胶、凝胶反复纯化，得到化合物(8.3 mg)、(6.5 mg)、(5.3 mg)。Fr.2经凝胶柱分离(氯仿/甲醇=1∶1，)，得到4个组分Fr.2-1～Fr.2-4。Fr.2-2经高效液相色谱制备 [乙腈(A)/水(B)，25%～55% A，0～45 min]，得到化合物(9.2 mg)；Fr.2-3经硅胶反复纯化(石油醚/乙酸乙酯=4∶1，)，得到化合物(9.5 mg)。Fr.3经凝胶柱分离(氯仿/甲醇=1∶1，)，得到5个组分Fr.3-1～Fr.3-5。Fr.3-4经硅胶柱色谱(石油醚/丙酮=5∶1→0∶1，)和半制备高效液相色谱纯化 [乙腈(A)/水(B)，5%～40%～60% A，0～30～55 min]，得到化合物(10.7 mg)。

取40%组分8.8 g过C柱纯化，依次使用体积分数为30%、50%、70%、95%的甲醇梯度洗脱，50 ℃减压浓缩，得到4个组分Fr.6～Fr.9。Fr.9经凝胶柱分离纯化(氯仿/甲醇=1∶1，)，得到4个组分Fr.9-1～Fr.9-4。Fr.9-2经高效液相色谱制备 [乙腈(A)/水(B), 32%～40%～60% A，0～30～45 min]，得到化合物(5.1 mg)、(9.5 mg)、(8.1 mg)、(6.8 mg)。

2.2 抗炎活性测试

抗炎活性测定参考文献(王淑慧等，2019)并略作修改。

不同极性部位的抗炎活性测定：取对数生长期的RAW 264.7细胞，制成浓度为每毫升5×10～6×10个的单细胞悬液，接种于12孔板中，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO的细胞培养箱中培养。培养24 h后，分别设置空白对照组、LPS组、药物组(95%乙醇提取物组、石油醚部位组、乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组和水部位组)，其中药物组(4个浓度)和LPS终浓度分别为12.5、25.0、50.0、100、0.20 μg·mL，每组设3个平行孔。继续培养24 h后，取上清，Griess法测定NO含量，并应用 SPSS 16.0 软件进行回归计算 IC值。

化合物抗炎活性测定：实验步骤同上，其中药物组(化合物-)给药终浓度分别为6.25、12.5、25.0、50.0 μmol·L。

3 化合物结构鉴定

化合物白色粉末。ESI-MS：371.3 [M+H]，分子式为CHO。H-NMR (500 MHz, CDCl),: 6.94 (1H, d，= 1.0 Hz, H-2′), 6.91 (1H, s, H-2), 6.85 (2H, m, H-6, 6′), 6.83 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.78 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 5.98 (2H, s, -OCHO-), 5.96 (2H, s, -OCHO-), 4.84 (1H, d,= 4.5 Hz, H-7′), 4.81 (1H, s, H-7), 4.49 (1H, dd,= 8.0, 9.5 Hz, H-9′b), 4.03 (1H, d,= 9.5 Hz, H-9b), 3.90 (1H, d,= 9.5 Hz, H-9a), 3.81 (1H, dd,= 6.5, 9.5 Hz, H-9′a), 3.04 (1H, m, H-8′);C-NMR (125 MHz, CDCl),:129.4 (C-1), 107.6 (C-2), 148.1 (C-3), 148.3 (C-4), 108.7 (C-5), 120.3 (C-6), 87.6 (C-7), 91.8 (C-8), 75.0 (C-9), 134.8 (C-1′), 107.0 (C-2′),147.4 (C-3′), 148.2 (C-4′), 108.3 (C-5′), 119.9 (C-6′), 86.0 (C-7′), 60.6 (C-8′), 71.8 (C-9′), 101.3, 101.4 (2 × -OCHO-)。以上数据与文献(冯薇和杨峻山，2010)基本一致，故鉴定为泡桐素(paulownin)。

化合物黄色粉末。ESI-MS：329.1 [M+H]，分子式为CHO。H-NMR (500 MHz, acetone-),: 12.93 (1H, s, 5-OH), 8.04 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′, H-6′), 7.13 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3′, H-5′), 6.86 (1H, s, H-3), 6.72 (1H, s, H-8), 3.99 (3H, s, 6-OCH), 3.92 (3H, s, 7-OCH), 3.80 (3H, s, 4′-OCH);C-NMR (125 MHz, acetone-),: 165.0 (C-2), 104.4 (C-3), 183.5 (C-4), 163.8 (C-5), 133.6 (C-6), 154.0 (C-7), 92.0 (C-8), 154.1 (C-9), 106.6 (C-10), 124.4 (C-1′), 129.1 (C-2′, 6′), 115.5 (C-3′, 5′), 160.2(C-4′), 60.6 (6-OCH), 56.8 (7-OCH), 56.0 (4′-OCH)。以上数据与文献(Shaheen et al., 2011)基本一致，故鉴定为鼠尾草素(salvigenin)。

化合物黄色油状物。ESI-MS：391.3 [M+H]，分子式为CHO。H-NMR (500 MHz, acetone-),: 8.14 (4H, s, H-3, 4, 6, 7), 4.27 (4H, m, H-1′, 1″), 1.73 (2H, m, H-2′, 2″), 0.95 (6H, t,= 7.5 Hz, H-8′, 8″), 0.92 (6H, t,= 7.5 Hz, H-6′, 6″);C-NMR (125 MHz, acetone-),: 166.1 (C-1, 8), 135.2 (C-2, 5), 130.3 (C-3, 4, 6, 7), 68.0 (C-1′, 1″), 39.8 (C-2′, 2″), 31.3 (C-3′, 3″), 29.7 (C-4′, 4″), 23.6 (C-5′, 5″), 14.3 (C-6′, 6″), 24.7 (C-7′, 7″), 11.4 (C-8′, 8″)。以上数据与文献(Dissanayake et al., 2016)基本一致，故鉴定为对苯二甲酸二辛酯 [bis-(2-ethylhexyl) terephthalate]。

化合物白色粉末。ESI-MS：403.2 [M+H]，分子式为CHNO。H-NMR (500 MHz, acetone-),: 7.82 (2H, d,= 7.0 Hz, H-3″, 7″), 7.52 (1H, t,= 7.5 Hz, H-5″), 7.42 (2H, t,= 8.0 Hz, H-4″, 6″), 4.84 (1H, m, NHCO), 4.08 (1H, m, NHCO), 3.21 (1H, dd,= 9.5, 13.5 Hz, H-3a), 3.03 (1H, dd,=9.5, 13.5 Hz, H-3b), 2.89 (1H, dd,= 7.5, 13.5 Hz, H-3′a), 2.75 (1H, dd,= 7.5, 13.5 Hz, H-3′b);C-NMR (125 MHz, acetone-),: 171.7 (C-1), 55.9 (C-2), 38.3 (C-3), 139.8 (C-4), 129.0 (C-5, 9), 130.2 (C-6, 8), 126.8 (C-7), 63.6 (C-1′), 53.9 (C-2′), 37.6 (C-3′), 138.9 (C-4′), 129.0 (C-5′, 9′), 130.2 (C-6′, 8′), 127.2 (C-7′), 167.4 (C-1″), 135.3 (C-2″), 128.2 (C-3″, 7″), 130.1 (C-4″, 6″), 132.2 (C-5″)。以上数据与文献(Xu et al., 2009；李柏榆等，2018)基本一致，故鉴定为-(-苯甲酰基-L-苯丙酰基)-L-苯基丙醇 [-(-benzoy-L-phenylalany)-L-phenylalanol]。

化合物淡黄色胶状物。ESI-MS：405.2 [M+H]，分子式为CHO。H-NMR (500 MHz, CDCl),: 6.64 (4H, s, H-2, 6, 2′, 6′), 5.59 (2H, s, 4, 4′-OH), 4.47(2H, d,= 6.0 Hz, H-7, 7′), 3.84 (12H, s, 3, 5, 3′, 5′-OCH), 2.30 (2H, m, H-8, 8′), 1.02 (6H, d,= 6.5 Hz, H-9, 9′);C-NMR (125 MHz, CDCl),: 133.3 (C-1, 1′), 103.2 (C-2, 6, 2′, 6′), 147.0 (C-3, 5, 3′, 5′), 134.1 (C-4, 4′), 87.5 (C-7, 7′), 44.3 (C-8, 8′), 13.1 6(C-9, 9′), 56.3 (3, 5, 3′, 5′-OCH)。以上数据与文献(季霄等，2014)基本一致，故鉴定为fragransin B。

化合物黄色晶体。ESI-MS：343.1 [M+H]，分子式为CHO。H-NMR (500 MHz, CDCl),: 7.82 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 7.00 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.81 (1H, s, H-5), 6.60 (1H, s, H-3), 3.99 (6H, s, 6, 8-OCH), 3.92 (3H, s, 7-OCH), 3.89 (3H, s, 4′-OCH);C-NMR (125 MHz, CDCl),: 161.3 (C-2), 107.0 (C-3), 177.4 (C-4), 96.3 (C-5), 157.7 (C-6), 140.4 (C-7), 152.6 (C-8), 154.6 (C-9), 112.8 (C-10), 123.8 (C-1′), 127.7 (C-2′, 6′), 114.4 (C-3′, 5′), 162.2 (C-4′), 56.4 (6-OCH), 61.6 (7-OCH), 62.3 (8-OCH), 55.6 (4′-OCH)。以上数据与文献(Shin et al., 2012)基本一致，故鉴定为6,7,8,4′-四甲氧基黄酮(6,7,8,4′-tetramethoxyflavone)。

化合物浅黄色油状。ESI-MS: 314.1 [M+H]，分子式为CHNO。H-NMR (500 MHz, CDOD),: 7.42 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 7.07 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 7.03 (2H, d,= 8.0 Hz, H-2′, 6′), 7.00 (1H, dd,= 2.0, 8.0 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.71 (2H, d,= 8.0 Hz, H-3′, 5′), 6.93 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8), 3.83 (3H, s, 3-OCH), 3.44 (2H, t,= 7.5 Hz, H-8′), 2.72 (2H, t,= 7.5 Hz, H-7′);C-NMR (125 MHz, CDOD),: 128.1 (C-1), 111.5 (C-2), 149.9 (C-3), 149.3 (C-4), 116.5 (C-5), 123.2 (C-6), 142.1 (C-7), 118.7 (C-8), 169.2 (C-9), 131.3 (C-1′), 130.7 (C-2′, 6′), 116.3 (C-3′, 5′), 156.8 (C-4′), 35.7 (C-7′), 42.5 (C-8′), 56.4 (3-OCH)。以上数据与文献(Darwish et al., 2003；杨洋等，2016)基本一致，故鉴定为-反式-阿魏酰酪胺(--feruloyltyramine)。

化合物浅黄色油状。ESI-MS/：314.1 [M+H]，分子式为CHNO。H-NMR (500 MHz, CDOD),: 7.36 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.99 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.92 (1H, dd,= 2.0, 8.0 Hz, H-6), 6.73 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.68 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.60 (1H, d,= 12.5 Hz, H-7), 5.80 (1H, d,= 12.5 Hz, H-8), 3.83 (3H, s, 3-OCH), 3.38 (2H, t,= 7.5 Hz, H-8′), 2.68 (2H, t,= 7.5 Hz, H-7′);C-NMR (125 MHz, CDOD),: 131.2 (C-1), 114.0 (C-2), 148.6 (C-3), 148.6 (C-4), 115.9 (C-5), 124.9 (C-6), 138.4 (C-7), 121.6 (C-8), 170.3 (C-9), 128.5 (C-1′), 130.7 (C-2′, 6′), 116.3 (C-3′, 5′), 156.9 (C-4′), 35.6 (C-7′), 42.4 (C-8′), 56.4 (3-OCH)。以上数据与文献(Hwang et al., 2016)基本一致，故鉴定为-顺式-阿魏酰酪胺(--feruloyltyramine)。

化合物白色粉末。ESI-MS：290 [M+Na]，分子式为CHNO。H-NMR (500 MHz, CDOD),: 7.54 (2H, m, H-2, 6), 7.53 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 7.37 (3H, m, H-3, 4, 5), 7.05 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.71 (2H, d,=8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.56 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8), 3.46 (2H, t,= 7.5 Hz, H-8′), 2.74 (2H, t,= 7.5 Hz, H-7′);C-NMR (125 MHz, CDOD),: 136.3 (C-1), 128.8 (C-2, 6), 129.9 (C-3, 5), 130.7 (C-4), 141.6 (C-7), 121.9 (C-8), 168.6 (C-9), 131.3 (C-1′), 130.8 (C-2′, 6′), 116.3 (C-3′, 5′), 35.8 (C-7′), 42.6 (C-8′)。以上数据与文献(冯文明等，2018)基本一致，故鉴定为--cinnamoyltyramine。

化合物浅黄色粉末。ESI-MS：324.2 [M+H]，分子式为CHNO。H-NMR (500 MHz, CDOD),: 7.42 (1H, d,= 8.0 Hz, H-7), 7.24 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4), 7.21 (1H, s, H-8), 7.11 (1H, m, H-6), 7.07 (1H, m, H-5), 6.08 (1H, dd,= 11.0, 17.5 Hz, H-17), 5.10 (1H, d,= 10.5 Hz, H-18a), 5.08 (1H, d,= 17.5 Hz, H-18b), 4.22 (1H, q,= 7.0 Hz, H-12), 1.55 (3H, s, H-19), 1.54 (3H, s, H-20), 1.52 (3H, d,= 7.0 Hz, H-15);C-NMR (125 MHz, CDOD),: 146.0 (C-2), 104.3 (C-3), 127.3 (C-3a), 119.8 (C-4), 121.2 (C-5), 122.6 (C-6), 112.7 (C-7), 136.9 (C-7a), 114.3 (C-8), 124.8 (C-9), 162.2 (C-10), 52.6 (C-12), 168.7 (C-13), 20.7 (C-15), 40.5 (C-16), 146.2 (C-17), 112.6 (C-18), 28.1 (C-19), 28.2 (C-20)。以上数据与文献(范翠梅等，2016)基本一致，故鉴定为新海胆灵A(neoechinulin A)。

4 抗炎测试结果

4.1 猫须草不同极性部位抗炎结果

由表1可知，除水部位外，其余部位均显示出抑制NO生成活性，中低极性的石油醚、乙酸乙酯部位抗炎活性最强，表明这两个部位是猫须草抗炎作用的主要部位。

表 1 不同极性部位对RAW 264.7细胞生成NO的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of different polarity fractions on NO production in RAW 264.7 cells

4.2 化合物抗炎活性结果

通过对从活性部位中得到的10个化合物进行抗炎活性筛选，由表2可知，化合物-表现出一定的抗炎活性，结构类型涉及黄酮、木脂素和酰胺类，其中获得的酰胺类成分(-)均显示出一定的NO生成抑制活性，表明该类成分是猫须草抗炎作用的主要成分之一。

表 2 化合物1-10对RAW 264.7细胞生成NO的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of compounds 1-10 on NO production in RAW 264.7 cells

5 讨论与结论

一氧化氮(NO)是一种高活性的含氮自由基，它既具有第二信使和神经递质的功能，又可以作为效应分子对动脉粥样硬化、关节炎、 痛风、 癌症等多种炎症性疾病的发生与发展过程起到重要调节作用(Bansal et al., 2016)，这种作用与其参与NF-κB、MAPK、JAK/STAT等多种信号通路密切相关，NO常作为判断炎症反应及抗炎药物筛选的重要指标。

本实验利用NO炎症模型对猫须草提取物及其化学成分进行抗炎活性评价，结果发现大部分化合物具有较好的NO生成抑制活性。多项研究也证实，-反式-阿魏酰酪胺()和-顺式-阿魏酰酪胺()在Hep3B细胞模型中能够抑制IL-6介导的STAT3激活(Hwang et al., 2016)。--cinnamoyltyramine()对环氧化酶Ⅰ/Ⅱ显出一定的抑制作用(Park, 2007)。在高剂量(0.45 g·kg)下，泡桐素()能够明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀和减少醋酸致小鼠扭体次数(李燕婧等，2007)。鼠尾草素()对脾细胞分泌IL-4和IFN-γ具有调节作用(Noori et al., 2013)。fragransin B()在体外能够抑制炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-8的产生，在体内耳肿胀炎症模型中，fragransin B的抗炎作用优于阿司匹林(Chen et al., 2020)。新海胆灵A()在高剂量下(100 μmol·L)才显示出较好的NO生成抑制作用，还能够抑制TNF-α、IL-1β分泌(Kim et al., 2013)。研究结果表明这些成分能够有效抑制炎症因子分泌，缓解炎症反应，以达到抗炎作用，是潜在的抗炎分子。从抗炎成分的结构类型来看，这些成分涉及黄酮、木脂素、含氮化合物等，表明猫须草抗炎作用是多类型成分共同作用的结果。本研究不仅阐明猫须草抗炎活性部位及其物质基础，还为其进一步在抗炎方面的开发利用提供理论依据。