异丙醇法提取超氧化物歧化酶的工艺优化研究

田小海 崔洪艳 王莘

摘 要：目的：探索优化异丙醇法从活性干酵母中提取超氧化物歧化酶的最佳工艺条件。方法：通过L9（34）正交试验设计，确定异丙醇浓度、搅拌时间、1次丙酮沉淀体积、2次丙酮沉淀体积对超氧化物歧化酶提取效果的影响，并采用邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶的活性。结果：最佳工艺条件：异丙醇浓度85%、搅拌时间16h、1次丙酮沉淀体积比（丙酮：粗提液）为0.8、2次丙酮沉淀体积比（丙酮：粗提液）为0.9，所得酶活性为810.00U/g，比活力为3240.00U/mg。结论：通过试验研究，改善了现有的异丙醇法从活性干酵母提取超氧化物歧化酶的工艺条件，减少了原料的消耗，节省了时间和能源。

关键词：活性干酵母；超氧化物歧化酶；提取工艺

中图分类号 TS201.3 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）21-0029-03

Study on Optimization of Extraction of Superoxide Dismutase by Isopropanol

Tian Xiaohai et al.

Abstract：Objective：Optimization of the best conditions for extraction of superoxide dismutase from active dried yeast by isopropanol.Method：The effects of isopropanol concentration，stirring time，primary acetone precipitation volume and secondary acetone precipitation volume on the extraction effect of superoxide dismutase were determined by the orthogonal test design of L9（34）.The activity of superoxide dismutase was determined by the autooxidation method of catechol.Result：Best process conditions：85% isopropanol concentration，16 H stirring time，first acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.8，second acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.9，the resulting enzyme activity is 810.00U/g，The specific activity is 340.00 U/mg.Conclusion：Best process conditions：85% isopropanol concentration，16 H stirring time，first acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.7，second acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.9，the resulting enzyme activity is 810.00U/g，The specific activity is 3240.00 U/mg. Conclusion：The present process of extraction of superoxide dismutase from active dry yeast by isopropanol was improved，which reduced the consumption of raw materials and saved time and energy.

Key words：Active dry yeast；Superoxide dismutase；The extraction process

超氧化物歧化酶又名肝蛋白，能專一地清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基并减少和阻止脂质的过氧化反应、延缓机体衰老，在生物体中具有重要功能[1，2]。目前，超氧化物歧化酶的主要来源是从牲畜动物血中提取，其安全性及质量均不稳定，且原料来源受到很大的限制[3]。随着发酵工业的发展，到了20世纪80年代后期，美国和日本先后利用发酵法生产超氧化物歧化酶，虽然大大降低了生产成本，但也存在着提取工艺复杂的问题。目前国内一些实验室研究利用酵母菌提取超氧化物歧化酶，酵母菌生产超氧化物歧化酶具有繁殖快、代谢时间短、产率高、易培养、易规模化生产、不受季节与自然条件的限制等优点[4]。根据文献报道酵母菌是众多微生物中超氧化物歧化酶含量最多的菌种之一[5]，本研究以酒精活性干酵母为提取原料，并对提取工艺进行优化。

1 方法与流程

1.1 菌种活化、保存与扩大培养 菌种活化（采用葡萄糖水培养基[6]）：取5g葡萄糖置于500mL三角瓶中，加水200mL，溶解后于电炉加热煮沸，冷却后于121.3℃，103.4kP灭菌20min。活性干酵母0.4g，35℃条件下加入活化液中，自然冷却至28℃后，置于28℃恒温水浴箱中水浴活化4h。斜面保存（采用葡萄糖蛋白胨琼脂培养基）：按葡萄糖∶蛋白胨∶琼脂∶酵母膏为8∶2∶2∶1的比例取量后加蒸馏水于121.3℃，103.4kP灭菌20min。取活化后菌种，在无菌工作台进行斜面接种，培养5d，冷藏保存备用。扩大培养（采用液体培养基[7]）∶按葡萄糖∶蛋白胨∶酵母膏∶磷酸二氢钾：七水硫酸镁为20∶5∶5∶2.5∶1的比例取量后加入微量Fe粉，加蒸馏水后于121.3℃，103.4kP灭菌20min。取适量保存菌种，接种后于28℃摇床培养24h后4000r/min离心10min后取湿菌体备用提取超氧化物歧化酶。

1.2 超氧化物歧化酶提取 采用异丙醇破壁，丙酮二次沉淀法。湿菌体与异丙醇（90%）按照1∶9的比例浸泡后抽滤除去有机溶剂，加入3倍体积、pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液，搅拌后4000r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液。

1.3 酒精活性干酵母超氧化物歧化酶纯化[8] 利用盐酸调pH至5.0，按丙酮∶粗酶液体积为1∶1的比例混合摇匀，静置一段时间后高速离心去除杂蛋白，调节pH至4.0为超氧化物歧化酶等电点，再按照适当的体积比混合丙酮与粗酶液后高速离心10min收集沉淀即可。

1.4 超氧化物歧化酶提取流程 酒精活性干酵母扩大培养→收集发酵液→离心收集菌体→异丙醇浸泡→抽滤去除有机溶剂→磷酸盐缓冲液搅拌处理→收集上清液→等电点沉淀法除杂蛋白→一次丙酮沉淀→等电点沉淀得超氧化物歧化酶→二次丙酮沉淀。

1.5 超氧化物歧化酶比活力测定方法[9] 活性干酵母超氧化物歧化酶酶活力测定：邻苯三酚自氧化法（酶活单位定义：在25℃恒温条件下，1mL反应液中，1min抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶活单位）。

2 仪器与材料

2.1 试验仪器 无菌工作台、恒温摇床、TDL-5离心机、多循环水式真空泵、恒温磁力搅拌器、PHS-3型酸度计、布氏漏斗、抽滤瓶、分光光度计（可见光和紫外光）、高压蒸汽灭菌箱、电子天平、三角瓶、烧杯、酸碱滴定管、移液管、玻璃棒、试管、接种环

2.2 试验材料 酒精活性干酵母（市售湖北安琪酵母公司生产）、异丙醇、丙酮、考马斯亮蓝G-250、磷酸缓冲溶液、Tris-HCL缓冲溶液、EDTA、邻苯三酚、蛋白胨、琼脂、酵母膏、葡萄糖、Fe粉、蒸馏水。

3 结果与分析

3.1 酒精活性干酵母超氧化物歧化酶提取的正交试验设计 通过文献报道与反复实验，确定提取工艺中的4个主要影响因素，分别是：A：异丙醇浓度；B：搅拌时间；C：1次丙酮浓度（体积比）；D：2次丙酮浓度（体积比），并根据文献与实验经验，进行水平取值，结果见表1，采用L9（34）正交实验设计方法，进行优化实验。

3.2 正交试验结果 通过正交试验结果分析，各项影响因素最佳水平组合为A2B1C2D2，即异丙醇浓度85%、搅拌时间16h、1次丙酮沉淀体积比（丙酮：粗提液）0.8、2次丙酮沉淀体积比（丙酮：粗提液）0.9。

3.3 优化提取工艺后试验结果 L9（34）正交实验有效地优化了活性干酵母超氧化物歧化酶的提取工艺，为了验证正交试验的结果，试验选取优化后的工艺技术参数进行反复试验，得出优化提取工艺后的试验结果见表3。从表3可知，粗提液中酶的比活力、1次丙酮沉淀后酶的比活力、2次丙酮沉淀后酶的比活力呈递进式增长，充分证明丙酮2次沉淀法纯化活性干酵母超氧化物歧化酶的重要作用，且此法生产工艺简单、成本低，具有一定的推广研究价值。

4 结论与讨论

异丙醇浓度水平取值为80%、85%、90%，实验证明：有机溶剂浓度为85%时，破壁提取效果最好好，选择85%。通过对正交实验结果进行极差分析，发现2次丙酮沉淀体积是最大的影响因素，优化后2次丙酮沉淀体积为0.9，搅拌时间是第2影响因素16h，且16h缩短了工艺流程，利于生产成本的降低，第3影响因素为1次丙酮沉淀体积，1次丙酮沉淀体积不能过高，否则导致过多超氧化物歧化酶随着杂蛋白沉淀，降低酶提取率，最小的影响因素为异丙醇浓度。

通过大量实验，证明从活性干酵母中提取SOD的最佳工艺为异丙醇-丙酮2次沉淀法，基本工艺流程与关键技术参数如下：A：菌种活化与保存备用（35℃加入活化液，30℃活化4h）；B：液体发酵扩大培养（28℃摇床振荡培养，150rpm，培养24h）；C：异丙醇法细胞破壁提酶（85%异丙醇，搅拌16h，测定酶活）；D：第1步纯化（1次丙酮沉淀）[丙酮：粗提液=0.8（体积比），测定酶活]；E：第2步纯化（2次丙酮沉淀）[丙酮：粗提液=0.9（体积比），测定酶活]。

通过查阅文献，对从酒精活性干酵母中制备的超氧化物歧化酶酶活性进行比较发现：采用酶裂解法、氯仿-乙醇法、细胞自溶法和石英砂研磨法提取超氧化物歧化酶[10]，酶活性分別为691.7U/g、225.8U/g、706.9U/g和236.67U/g。在此次试验过程中经过优化的异丙醇-丙酮2次沉淀法酶活性为810.00U/g。因此，试验中获得的酶活性较高优于其他4种方法。

参考文献

[1]曾士廉，张宏.啤酒废酵母超氧物歧化酶（超氧化物歧化酶）的分离纯化及性质研究[J].安徽大学学报（自然科学版），1995（2）：88-92.

[2]Mccord J，Fridovich I.Superoxide dismutase[J].J Biol chem.，1969，244：6049.

[3]明景熙.从啤酒酵母中提取超氧化物歧化酶的几种工艺方法[J].中国酿造，2003，14（4）：7-8；11.

[4]苏昕，阎浩林，梁丽莉.酵母超氧化物歧化酶分离纯化及其酶学性质的研究[J].沈阳药科大学学报，2005，22（1）：67-70.

[5]吴江，陈代杰.微生物中超氧化物歧化酶含量及分布[J].中国医药杂志，1997，28（11）：495-498.

[6]姚娟，肖亚光，王亚楠.“安琪”啤酒活性干酵母酿造特性研究[J].酿造科技，2003（6）：40-41.

[7]王岁楼，张平之，张欣，等.酵母超氧化物歧化酶形成的生理学研究[J].工业微生物，1997，27（3）：20-23.

[8]李宏，单振秀，王宜林，等.红酵母提取超氧化物歧化酶的研究[J].食品科学，2003，24（12）：81-84.

[9]Marklund S，Marklund G.Involvement of the superoxide anionradical in the autoxidation of pyorgallol and a convenient assay for superoxide dismutase[J].Eur J Biochem，1974，47：469.

（责编：张宏民）