百子莲体细胞发育受体激酶APSERK1（Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1）基因全长克隆及表达分析

张琰 石玉波

摘 要：根据前期百子莲（Agapanthus praecox ssp.orientalis）转录组测序分析的结果，获得了1个与胚性能力相关的关键基因Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1（SERK1）同源性较高的核心片段。采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）方法得到了百子莲SERK基因cDNA全长序列，命名为ApSERK1。序列分析表明，百子莲ApSERK1基因开放阅读框（ORF）为1800bp，编码1个含有600个氨基酸的蛋白质。氨基酸同源性比对发现，百子莲ApSERK1蛋白序列与水稻、小兰屿蝴蝶兰、铁皮石斛、椰子树和菠萝等植物蛋白序列的相似性可达到90%以上。实时荧光定量qRT-PCR结果表明，ApSERK1基因有一定时空表达差异，在百子莲的种子、小花梗中表达含量最高，且随着外源生长素浓度的增加，胚性愈伤组织的胚性能力呈现下降趋势。推测ApSERK1基因是衡量植物细胞胚性能力的重要指标。

关键词：百子莲；体细胞发育受体激酶；基因克隆；表达分析

中图分类号 S682.32 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）21-0036-05

Molecular Cloning and Expression Analysis of Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1 in Agapanthus praecox

Zhang Yan et al.

（1Shanghai Vocational Technical College of Agriculture and Forestry，Shanghai 201600，China）

Abstract：A core fragment highly homologous with the key gene of embryo ability pathway， Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1（SERK1 was obtained on the basis of preliminary Agapanthus praecox ssp. orientalis transcriptome sequencingresults. The full length sequence of cDNA， the SERK1 gene of A. praecox was gained by the RACE method， which was named ApSERK1 . The results of sequence analysis showed that the full length of cDNA was 1800bp， which was composed of 600 encoded amino acids.The amino acid homology comparison found that the ApSERK1 protein sequence of baizilian could be more than 90% similar to the plant protein sequences of rice， xiaolangyu butterfly orchid， dendrobium candidum， coconut tree and pineapple.The results of real-time quantitative PCR showed that ApSERK1 gene had a certain temporal and spatial expression difference， with the highest expression content in the seed and floret stalk， and the germinal capacity of embryonal callus decreased with the increase of exogenous auxin concentration.It is speculated that ApSERK1 gene is an important indicator of the embryonic ability of plant cells.

Key words：Agapanthus praecox ssp. orientalis；Somatic cell Receptor kinase；Gene cloning；Expression analysis

基于德國植物生理学家Haberlandt（1902）提出的细胞全能性（Cell Totipotency）理论[1]，植物体细胞胚胎发生（Somatic Embryogenesis，SE）是指在离体培养条件下，单倍体或双倍体的体细胞向类似合子胚的体细胞胚胎（Somatic Embryos）发生方式转变，并发育成新个体的形态发生过程[2]。自从1958 年英国生物学家F.C.Steward和J.Reinert分别以胡萝卜的根系作为外植体成功诱导出体细胞再生植株以来[3]，目前在裸子植物、双子叶植物、单子叶植物中已有300多种植物利用其茎段、下胚轴、子叶、叶片、叶柄、果肉、花芽、根、合子胚、胚乳等作为外植体建立了SE 技术体系[4]。体细胞发育受体激酶 SERK（Somatic Embryogenesis Recepotor Kinase）基因无疑是检验植物体细胞体系建立的1个关键性基因。1997年Schmidt等首先从胡萝卜悬浮胚性细胞中检测出DcSERK基因的差异表达，并将其作为胚性能力检验的首要分子标记物[5]。Hecht等（2008）也从拟南芥中克隆了定位于亚细胞的膜蛋白基因AtSERK1～ AtSERK5，推断SERK在某个节点上与SE激素信号通路之间相互作用[6]。

百子莲（Agapanthus praecox ssp. orientalis）又称蓝百合，为百子莲科百子莲属的单子叶多年生球根花卉，原产于非洲南部的热带与亚热带地区。百子莲属植物花序硕大、花色优雅、株形整齐，观赏性很强，是国外植物造景中常用的植物资源。我国最早于2002年将百子莲引入上海，研究中发现其花芽分化时受到温度影响结实率很低[7]，因此建立了百子莲体细胞培养体系（Somatic Embryogenesis，EC）[8]。SERK作为体细胞胚胎发育的关键基因，在单子叶植物百子莲及其体细胞发育的研究中还没有报道。笔者克隆得到了百子莲体细胞受体激酶APSERK1，并利用实时荧光定量分析的方法，对百子莲不同发育时期各组织、不同体细胞中的APSERK1进行了相对定量表达分析，为进一步了解SERK在百子莲体细胞发育过程中的表达模式和作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验材料为2002年由南非引入我国上海地区的百子莲（Agapanthus praecox ssp.orientalis），取百子莲胚性愈伤组织（EC）提取总RNA，进行cDNA的RACE扩增。

1.2 实验方法

1.2.1 cDNA核心序列的获得 根据前期百子莲转录组测序分析结果，得到百子莲SERK（1749bp）同源基因的核心序列，使用Primer5软件设计引物3-GSP1和3-GSP2、5-GSP1和5-GSP2。以百子莲胚性愈伤组织（EC）的cDNA为模板进行目的片段扩增，引物序列见表1。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、60～65℃退火30s、72℃延伸30～90s（视产物片段大小而定），35个循环；72℃保持5min，使产物延伸完整。反应程序结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测（120V，30min），观察条带位置与亮度，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收。

1.2.2 SERK基因全长克隆 以提取百子莲胚性愈伤组织的总RNA为模板，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）扩增试剂盒进行3′RACE和5′RACE cDNA文库的构建。以SERK-F1、UPM和SERK-R1、UPM作为3′ RACE和5′RACE扩增的第1轮引物，根据获得的目的片段序列，使用Primer 5软件设计3′RACE巢式PCR引物SERK-F2和SERK-F3，以百子莲3′RACE cDNA文库（1μL）为模板，按SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）扩增试剂盒说明书进行操作，获得3′端序列。将获取的目的片段序列和3′ RACE序列拼接后，设计5′RACE巢式PCR引物SERK-R2，按上述扩增试剂盒说明书操作，获得5′端序列。将3′端序列、中间目的片段序列和5′端序列拼接后，设计SERK基因全长特异性引物SERK-F1和SERK-R3，通过PCR扩增，克隆、测序，获得该基因全长序列。

1.2.3 生物信息学分析 利用NCBI网站上的BLASTx程序进行序列相似性分析；使用GenBank ORFfinder和在线网站（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）进行开放阅读框的预测以及蛋白1级结构（理论等电点和分子量）的分析；应用DNAman软件进行同源性比较分析；利用瑞士模型预测网站（http：//swissmodel.expasy.org/）进行蛋白3级结构预测分析。

1.2.4 荧光定量PCR 通过实时荧光定量qRT-PCR方法分析SERK在不同发育阶段、不同组织中的表达情况。使用Beacon Designer 7软件设计qRT-PCR引物qSERK-F和qSERK-R。利用FTC-3000TMSYSTEM实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR反应，反应体系为：SYBR Premix Ex Taq II（2X）10μL、primer（10μm）各0.5μL、cDNA 2.0μL、RNase-free H2O up to 20μL。反应程序设置94℃预变性60s；94℃变性10s，56℃退火15s，72℃延伸25s，共40个循环。反应完成后计算平均值和标准差，采用2-ΔΔCt法[9]进行数据分析，所用百子莲内参基因为Actin。所有样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取与APSERK1基因核心片段的获得 RNA的质量是决定基因克隆成败的关键，高纯度完整的RNA是基因克隆的基础和保障。以百子莲胚性愈伤组织作为试验材料，进行RNA的提取，并反转录为cDNA，以期望得到较为全面的转录信息。试验选用上海英潍捷基生物技术有限公司的Trizol试剂提取百子莲总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测，28s、18s和5s条带清晰，且28s、18s条带之间无明显弥散现象，28s是18s亮度的2倍左右，表明提取的总RNA样品较完整，无明显降解现象（图1a）。用Thermo NanoDrop1000 微量紫外分光光度计测量A260/A280 比值为2.07，比值在2.0左右；A260/A230 比值分别为2.24，比值大于2，浓度为1562.0ng/μL，说明此方法提取的RNA样品纯度较高，可用于继续开展后续试验。

根据百子莲转录组测序结果，得到了百子莲ApSERK1基因片段762 bp，根据已知序列设计1组引物进行PCR扩增，经PCR扩增，得到单一目的条带的产物。序列经BLASTp分析表明，该片段与多種植物的SERK基因具有很高的同源性，推定其为百子莲APSERK1基因片段（图1b）。在此基础上，根据确定的目的片段分别进行后续的3，5RACE。

2.2 APSERK1基因的全长序列获得 通过3′RACE第2轮和第3轮巢式PCR分别获得1081bp和885bp（图2）的cDNA片段，拼接后得到3′RACE945bp的cDNA片段。5′RACE经两轮巢式PCR后获得1814bp（图3）的cDNA片段，将3′RACE序列、核心序列和5′RACE获得的序列进行比对拼接后，得到2332bp的SERKcDNA全长序列，其中A、T、G、C4种碱基含量分别为26.8%（A）、28.47%（T）、24.5%（G）和20.15%（C）。经NCBI的ORF Finder分析，ApSERK1基因开放阅读框（ORF）为1800bp，编码1个含有600个氨基酸的蛋白质（图4）。

2.3 APSERK1氨基酸序列分析 运用Protparam网站对百子莲ApSERK1进行了相关理化性质分析，推断出ApSERK1蛋白质相对分子量为160.59kD，等电点（pI）为4.94。对预测的ApSERK1蛋白序列2级结构预测分析发现，ApSERK1中含有52.54%的ɑ-螺旋、30.14%的无规则卷曲、3.21%的β-转角和14.11%的延伸链。图5所示为百子莲ApSERK1蛋白序列的3级网络结构。

2.4 APSERK1的同源性比较 运用NCBI网站上的BLASTx软件对ApSERK1进行同源性序列比对，并用DNAman软件进行其氨基酸序列同源性比较分析结果表明，百子莲ApSERK1蛋白序列与其他植物的体细胞受体激酶具有非常高的相似性，与水稻（XP_015649858.1）、小兰屿蝴蝶兰（XP_020586612.1）、铁皮石斛（NP_020698803.1）、椰子树（AAV58833.2）和菠萝（XP_020081964.1）等植物蛋白序列的相似性可达到90%以上（图6）。

受体激酶的多序列比对（阴影部分为完全相同的氨基酸）

2.5 APSERK1的空间表达分析 采用实时荧光定量PCR对百子莲根、茎、叶片、花葶、花器官、种子等不同器官中ApSERK1基因的表达进行了分析。结果显示，百子莲成熟种子中ApSERK1表达量最高，分别是小花梗、花瓣、子房、花药、根、老叶、新叶、花丝、茎和花葶的1.88、2.24、3.06、3.48、3.51、4.40、4.97、5.73、6.58和7.62倍；表明在各器官中，百子莲成熟种子的胚性能力最强，其次是花器官，最后是根与叶；在花器官中，以小花梗中的ApSERK1表达量最高，分别是花瓣、子房和花药的1.19、1.62、1.85倍（图7）。

进一步对不同浓度毒莠定（PIC）处理下的百子莲的胚性愈伤组织进行了PCR检测，分析得出PIC1.0浓度处理的胚性愈伤组织中的ApSERK1表达量最高，分别是1.5浓度、2.0浓度处理的1.6和4倍，表明随着外源生长素浓度的增加，胚性愈伤组织的胚性能力呈现下降趋势（图8）。

3 结论与讨论

从百子莲中克隆得到SERK同源基因DNA全长序列，并命名为ApSERK1。ApSERK1基因开放阅读框（ORF）为1800bp，编码1个含有600个氨基酸的蛋白质，运用生物信息学BLASTx软件对ApSERK1进行同源性序列比对分析结果显示，其与水稻、蝴蝶兰、铁皮石斛等单子叶植物中已经分离的SERK基因有非常高的同源性。目前已经在马尾松[10]、挪威云杉[11，12]、白云杉[13，14]、日本落叶松[15]、墨西哥垂松[16]、火炬松[17]、辐射松[18]、川西云杉[19]等裸子植物和水稻[20]、紫花苜蓿[21-22]、菊苣[23]、香石竹[24]、矮牵牛[25]、唐菖蒲[26]、仙客来[27]、棉花[28]、大豆[28]、龙眼[29]等被子植物上克隆得到了SERK的同源基因。其中很多植物中都已经证明SERK受体激酶不仅是胚性能力的体现，同时参与了油菜素内酯代谢与合成途径，生长素反应与油菜素内酯反应所涉及的基因具有重叠性，通常生长素抑制的基因也能被油菜素内酯所抑制，表明两者的信号通道有着某种联系，而植物想要保持胚性必须运用外源的各类生长素进行诱导和调节[30]。

通过实时荧光定量分析可以看出，ApSERK1基因有一定时空表达差异，在百子莲不同组织器官中都有表达，在种子、小花梗中表达含量最高，且随着外源生长素浓度的增加，胚性愈伤组织的胚性能力呈现下降趋势。范现丽在2009年建立了百子莲的体细胞培养体系，其中分别用了百子莲的根、花葶、叶以及各花器官做了诱导实验，无论是在愈伤组织诱导阶段还是在胚性愈伤组织诱导阶段，百子莲的小花梗始终是诱导材料的首选[8]。虽然百子莲的种子是胚性最强的器官，但由于其在上海地区结实率很低[7]，主要依靠国外进口，因此百子莲的小花梗依旧是其诱导体细胞的最佳选择。研究中推测ApSERK1基因也是具有生物功能的SERK类似基因，具体怎样调节百子莲的体细胞使其保持胚性，还需要做进一步深入研究。

结合前期研究结果，百子莲ApSERK1全长cDNA的成功克隆对进一步探讨其表达调控特征和分析表达产物的生化特性提供了理论依据，为在分子水平上研究百子莲体细胞胚性保持与胚性丧失等方面的尝试奠定了基础，此研究对深入探讨百子莲胚性保持机制，揭示植物激素信号转导路径等方面具有重要的意义。

参考文献

[1]Bourne G H， Danielli J F. International review of cytology[M].New York：Academic Press， 1963.

[2]崔凯荣，戴若兰.植物体细胞胚胎发生的分子生物学[M].北京：科学出版社，2000.

[3]Steward F C， Mapes M O， Smith J. Growth and organized development of cultured cells. I. Growth and division of freely suspendedcells[J]. American Journal of Botany， 1958： 693-703.

[4]湯浩茹，王永清，任正隆.果树的体细胞胚发生[J].四川农业大学学报，1999， 17（1）：71-79.

[5]PF Mccabe，RI Pennell.Soluble signals from cells identified at the cell wall establish a development pathway in carrot[J].Plant Cell，1997，9（12）：2225-2241.

[6]C Albrecht，E Russinova，B Kemmerling，et al.Arabidopsis SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE proteins serve brassinosteroid-dependent and independent signaling pathways[J].Plant Physology，2008，148（1）：611-619.

[7]张荻. 百子莲花芽分化及开花肌理研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2009.

[8]范现丽. 蓝百合快速繁殖技术的研究[D].上海：上海交通大学，2009.

[9]Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C （T）） method[J]. Methods，2001，25：402-408.

[10]黄健秋，卫志明，许智宏.马尾松成熟合子胚的体细胞胚胎发生和植株再生[J].植物学报，1995，37（4）：289-294.

[11]于晓芳. 马尾松胚性愈伤组织诱导与增殖研究[D].湖南： 中南林业科技大学，2012.

[12]Helena I H， Annika S L， Geeta B， et al. KNOTTED1-like homeobox genes of aymnosperm， Norwayspruce， expressed during somatic embryogenesis[J].Plant Physiol.Biochem，2002，40：837-843.

[13]Aro V R， Johannes V S. Changes in competence for somatic embryogenesis in Norway spruce zygoticembryo segments[J]. Journal of Plant Physiology， 2005， 162： 583-588.

[14]Stasolla C， Yeung EC.Recent advances in conifer somatic embryogenesis：improving somatic embryoquality[J].Plant Cell Tiss Org Cult，2003，74：15-35.

[15]Mark F B， Julie M， Edward C Y， et al. The effect of osmoticum on ascorbate and glutathione metabolismduring white spruce （Piceaglauca） somatic embryo development[J].Plant Physiology and Biochemistry，2005， 43： 337-346.

[16]Mikihisa U， Shinjiro O， Hamako S， et al. Two stimulatory effects of the peptidyl growth factorphytosulfokine during somatic embryogenesis in Japanese larch （Larixleptolepis Gordon） [J]. PlantScience， 2005， 169： 901-907.

[17]Malabadi R B， Staden V J. Cold-enhanced somatic embryogenesis in Pinuspatula is mediated by calcium[J]. South African Journal of Botany， 2006， 72： 613-618.

[18]Pullman S G， Chopra R， Chase K M， et al. Loblolly pine （Pinustaeda L.） somatic embryogenesis：Improvements in embryogenic tissue initiation by supplementation of medium with organic acids，Vitamins B12 and E[J]. Plant Science， 2006， 170： 648-658.

[19]Aquea F， Johnson P A.Identification of genes expressed during early somatic embryogenesis in Pinusradiate[J].Plant Physiology and Biochemistry，2008，46：559-568.

[20]Ozawa K，Komamine A.Establishment of a system of high-frequency embryogenesis from long-term cellsuspension cultures of rice（Oryza sativa L.）[J].TheorAppl Genet，1989，77：205-211.

[21]賀晓，慈忠玲，孔繁敏.紫花苜蓿体细胞胚胎发生及其细胞组织学观察[J].内蒙古林学院学报，1999，21（2）：44-48.

[22]王强龙，王锁民，张金林，等. 紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系的建立[J].草业科学，2006，23（11）：21-27.

[23]Axelle B， Lionel B， Pierre ES， et al. 9-kDa acidic and basic ns LTP-like proteins are secreted in theculture-medium conditioned by somatic embryogenesis in Cichorium [J]. Plant Physiol. Biochem，2002，40： 339-345.

[24]Aparna P， Kothari S L. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf cultures ofornamental species of Dianthus[J]. Scientia Horticulturae， 2003， 98： 449-459.

[25]崔广荣，廖玲玲，张子学，等. 矮牵牛叶片体细胞胚胎发生发育的组织学观察[J]. 生物学杂志，2007，24（1）：70-72.

[26]车代弟，龚束芳，郑洋，等.唐菖蒲体细胞胚的诱导及植株再生[J].分子植物育种， 2008， 6（3）：527-531.

[27]Lyngved R， Snipen L G， Iversen T H， et al. Influence of potential growth factors on the production ofproembryogenic masses of Cyclamen persicum Mill. in bioreactors[J].Scientia Horticulturae，2008，118：53-59.

[28]王志才，木合热皮亚·艾尔肯，廖茂森，等.影响棉花体细胞胚胎发生和植株再生的关键因素分析[J].新疆农业科学，2011，48（1）：39-44.

[29]雷海英，武擘，贾彥琼，等. 大豆体细胞胚胎发生再生体系的建立与优化[J].华北农学报，2012，27（3）：29-34.

[30]赖钟雄，潘良镇，陈振光. 龙眼胚性细胞系的建立与保持[J].福建农业大学学报，1997， 26（2）：160-167.

（责编：徐世红）