2种提取灵芝菌丝体基因组DNA方法的比较

孙墨可 李晓薇 张曼 田娟 董玉迪

摘 要：比较2种DNA提取方法提取灵芝菌丝体基因组DNA之间的差异，分别用改良的CTAB法和TPS法提取10株菌丝体基因组DNA，用超微量紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳的方法进行浓度及纯度的测定。结果表明：利用改良的CTAB法提取灵芝菌丝体基因组DNA得到的浓度与纯度较高，但耗费时间较长；利用TPS法提取的灵芝菌丝体基因组浓度与纯度相对较低，但相对耗费时间较短；这2种方法提取的基因组都可以用于后续的PCR扩增反应。

关键词：灵芝；CTAB；TPS；基因组

中图分类号 S567.31 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）21-0034-02

灵芝（Ganoderma lingzhi）是我国著名的食药用真菌，有着悠久的历史文化[1]。灵芝含有多糖、萜类化合物、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等多种活性成分。现代药理研究表明，灵芝具有保肝、抗肿瘤、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抗组织胺释放、抑制血管紧张素、抗氧化、调节免疫及延缓衰老的作用[2-6]。当前对灵芝分子生物学研究不断深入，如灵芝中的基因克隆与表达，转化体系的建立等[7-9]。灵芝基因组的提取是进行后续分子生物学研究的基础，基因组DNA的质量直接影响后续实验的质量，实验过程耗时少也是许多研究者的追求。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性[10]。TPS法是一种快速提取小量DNA的方法，最初用到水稻上。笔者利用CTAB法与TPS法分别提取灵芝基因组DNA以进行比较，旨在为今后灵芝分子生物学方面的科研提供较适宜的DNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 菌株 灵芝（G.lingzhi）由吉林农业大学菌物研究所提供。取生长在PDA培养基上的7～10d的灵芝菌丝10株，进行灵芝基因组DNA的提取。

1.2 试剂与仪器 试剂：Tris-HCl，EDTA，KCl，氯仿，异戊醇，异丙醇，乙醇等。仪器：人工气候培养箱（日本日立），电泳仪（JUNYI），离心机，凝胶成像系统（美国UVP），超微量紫外可见分光光度计（Thermo），电子天平（Denver）等。

1.3 方法

1.3.1 CTAB法提取灵芝基因组 CTAB法提取基因组步骤如下：1）将灵芝菌丝加液氮研磨成粉末状；2）加入700μL的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次，20min后放入离心机中12000r/min，离心15min；3）小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μL）溶液，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；4）小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000r/min，离心10min；5）重复步骤（4）1～2次，以蛋白层不出现为止；6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，離心10min；7）弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；8）室温下超净台干燥后，溶于50uLddH2O溶解DNA，于-20℃保存。用超微量紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳的方法进行浓度及纯度的测定。

1.3.2 TPS法提取灵芝基因组 TPS法提取灵芝基因组步骤如下：1）将灵芝菌丝加液氮研磨成粉末状加入65℃预热的TPS DNA提取液700uL，充分混匀；2）65℃水浴30min，期间颠倒混匀3～4次；3）加入氯仿/异戊醇/乙醇（体积比为20∶1∶4），混合摇匀，4℃，12000r/min，离心10min，转移上清至新的离心管中；4）加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置10min，4℃，12000r/min，离心10min，弃上清；5）加70%乙醇500uL洗涤沉淀，4℃，12000r/min，低速离心5min，弃上清，超净台吹干沉淀，加入50uLddH2O溶解DNA；6）置于-20℃保存。用超微量紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳的方法进行浓度及纯度的测定。

1.3.3 紫外分光光度计检测DNA 取DNA样品1μL，用超微量紫外可见分光光度计测定DNA样本在260nm和280nm的吸光度A，DNA纯度以A260/A280的值确定，同时测定提取DNA的浓度。

1.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 配制1%的琼脂糖凝胶，取2μL DNA样品，120V电泳25min，凝胶成像系统分析电泳结果，对提取DNA进行完整性检测。

2 结果与分析

2.1 DNA浓度及纯度 利用CTAB法和TPS提取出的灵芝基因组DNA分别用超微量紫外分光光度计测定（见表1），2种方法提取的DNA吸光度比值都符合标准。CTAB法提取的DNA浓度平均值为197.81μg/mL，TPS法提取的DNA浓度值平均为44.78μg/mL。CTAB法提取的DNA比TPS法提取的DNA浓度要高。

2.2 DNA完整性的测定 利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA，检测结果见图1，用凝胶成像系统分析电泳结果并成像，对提取DNA进行完整性检测。CTAB法DNA量较多，条带清晰。TPS法提取的DNA量相对较少，但完整性很好，没有降解。

3 结论

DNA的提取是进行分子生物学研究的基础[11]。在灵芝分子生物学实验中，DNA提取大多数使用的是CTAB法。该方法程序复杂，从取样到提取出基因组DNA，需要6～8h，但提取出的DNA质量较高。TPS法是一种快速提取小量DNA的方法，最初用在水稻上。与CTAB法相比，TPS法简化了操作步骤，节省了时间，但提取出的DNA质量相对较低，适合小量检测应用。2种方法各有利弊，可根据具体的条件选择合适的方法。近年来，许多学者也相继开展了灵芝的分子生物学研究工作，因此提高灵芝基因组DNA提取方法，对于提高灵芝后续的分子生物学研究有重要的意义。

参考文献

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[10]胡根海，喻树迅.利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA[J].棉花学报，2007，19（1）：69-70.

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（责编：徐世红）