笃斯越桔花色苷纯化工艺的研究

时间：2024-05-24

摘要：比较6种大孔树脂对笃斯越桔花色苷的吸附和解吸效果，筛选适合笃斯越桔分离纯化的树脂类型，并对其吸附性能进行研究，获得适合的树脂及动态吸附和解吸的最佳条件。研究结果表明：AB-8大孔树脂为越桔花色苷吸附和解吸效果最佳的树脂类型;花色苷粗提物用pH值为3的缓冲液配制、上样流速为1.0 mL/min、上样浓度为1.5 mg/mL、上样体积为400 mL，采用90 mL的60%乙醇溶液以1.0 mL/min的流速进行花色苷解吸，效果较好。

关键词：花色苷; 笃斯越桔; 树脂

中图分类号： S 663. 9， TS 201. 2 文献标识码： A 文章编号：1001 - 9499（2019）06 - 0031 - 05

花色苷粗提物中一般含有较多杂质，为了提高其纯度，便于开展下一步研究，并为其大规模工业化生产提供理论依据，应对花色苷粗提物進行纯化处理[ 1 ]。本文比较了6种大孔树脂对笃斯越桔花色苷的吸附和解吸效果，对其吸附性能进行研究，旨在排除其他杂质的干扰，为进一步研究越桔花色苷的抗氧化活性提供高纯度的花色苷，也为越桔花色苷分离纯化的产业化提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 花色苷粗提物的制备

笃斯越桔果实采集地位于大兴安岭北部林区，地理坐标 124°25′E、51°43′N，海拔为512 m。8月份，选用水湿地有土生境类型采摘的野生笃斯越桔果实作为原料，果实利用液氮研磨破碎，采用乙醇/水/盐酸（80∶19∶1，v/v）溶剂体系，以1∶24的料液比、650 W的超声功率进行25 min超声辅助提取，离心取上清液，残渣以同样条件提取2次。合并后的上清液在30 ℃下旋蒸浓缩，浓缩液再经冷冻干燥得紫黑色的越桔花色苷粗提物，密封放入 -80 ℃冰箱备用。

1. 2 试剂与标样

试验用试剂柠檬酸、柠檬酸纳、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇，均为分析纯试剂。6种树脂的物理性质见表1，其中，HPD-100、HPD-300型树脂，购于河北沧州宝恩化工有限公司;AB-8型树脂，购于天津南开大学化工厂;LS-300b、NKA-2、NKA-9型树脂，购于西安蓝深特种树脂有限公司。标样二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，购于Sigma公司。试验用主要仪器设备见表2。

1. 3 花色苷含量的测定方法

花色苷含量的测定采用示差法[ 1 ]并略加改进。花色苷提取液分别与0.025 M的NaCl缓冲液（pH=1）和0.4 M的CH3COONa缓冲液（pH=4.5）以1/8（v/v）的比例混合;与NaCl缓冲液混合的样品利用分光光度计在400～750 nm的波长范围内扫描，用以确定其最大吸收波长λvis-max，每个花色苷提取样品均在λvis-max和700 nm的波长下读取吸光值。所有样品均在配制15 min后测定，并在1 h内完成。将吸光值换算为花色苷含量（TAC），表示为mg二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（MGE）/100 g鲜果（FM）。计算公式

TAC （mg MGE/100g FM） = （A×MW×DF×V）×105/（ε×L×M）

A = （A-A）-（A-A）

式中：A——吸光值;

MW——二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的摩尔质量（493 mol/g）;

ε——二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的摩尔吸光系数（21200）;

L——液层厚度（1 cm）;

M——原料鲜果重（g）。

1. 4 最佳树脂的筛选

1. 4. 1 树脂预处理

树脂在无水乙醇中浸泡溶胀24 h，再用无水乙醇洗至流出液加入适量水至白色浑浊为止，然后用去离子水洗去乙醇，最后吸干树脂中的水分。

1. 4. 2 树脂吸附率和解吸率的测定

分别称取经预处理后的6种树脂各2 g，放入100 mL三角瓶中，花色苷粗提物用pH值3.0的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液配制成2 mg/mL的溶液，在最大吸收波长λvis-max下测定其吸光值A0。在6个盛有树脂的三角瓶中分别加入花色苷溶液，再将它们放入水浴振荡器中，室温下以150 r/min震荡12 h，抽滤后测滤液吸光值A1。将50 mL、60%的乙醇溶液（pH=3.0）加入到抽滤的树脂中，室温下以150 r/min震荡12 h，抽滤后测滤液吸光值A2。吸附率α和解吸率β的计算公式

α=（A-A）/A×100%;

β=A /（A-A） ×100%

1. 5 笃斯越桔花色苷的静态吸附

1. 5. 1 花色苷在树脂上吸附平衡时间的测定

将预处理后的选定树脂加入到100 mL三角瓶中，再将50 mL、pH 值3.0、吸光值A0的花色苷溶液加入其中，将其置于水浴振荡器以100 r/min在室温下震荡，每隔30 min测定溶液的吸光值Ai，吸附率按照公式α=（A0-Ai）/A0×100%计算，并用吸附率对时间作图，绘制花色苷静态吸附动力学曲线。

1. 5. 2 花色苷在树脂上解吸平衡时间的测定

将2 g吸附花色苷的饱和树脂加入到50 mL、 60%的乙醇溶液（pH=3.0）中，然后在30 ℃下以110 r/min震荡，每隔30 min吸取200 μL的花色苷解吸液，测定其吸光值，并用解吸率对时间作图，绘制花色苷静态解吸动力学曲线。

1. 5. 3 pH值对树脂吸附花色苷影响的测定

用缓冲液配制成不同pH值（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）、浓度为2 mg/mL的花色苷溶液，分别测定其吸光值A0;吸取各pH值的花色苷溶液50 mL加入到装有2 g树脂的100 mL三角瓶中，置于水浴振荡器中以100 r/min在室温下震荡，吸附后测定吸光值A1，并计算吸附率。

1. 5. 4 乙醇体积分数对树脂吸附花色苷影响的测定

将50 mL不同体积分数的最佳pH值的乙醇溶液（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）分别加入到装有2 g吸附花色苷饱和树脂的100 mL三角瓶中，置于水浴振荡器中以100 r/min在室温下震荡，测定不同体积分数的花色苷洗脱液的吸光值A2，并计算解吸率。

1. 6 笃斯越桔花色苷的动态吸附

1. 6. 1 吸附流速对树脂吸附花色苷的影响

取20 g预处理后的树脂进行湿法装柱，利用缓冲液配制最佳pH值的花色苷溶液，其吸光值为A0，分别采用不同的流速（0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min）使一定体积的花色苷溶液流经树脂柱;溶液全部通过树脂柱后，分别测定各流速下的流出液吸光值A1，并计算其吸附率。

1. 6. 2 粗提物浓度对树脂吸附花色苷的影响

将笃斯越桔花色苷粗提物用最佳pH值的缓冲液配制成不同浓度的溶液（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL），并分别测定它们的吸光值A0，以最佳流速使花色苷溶液流经树脂柱，溶液全部通过树脂柱后，检测不同粗提物浓度流出液的吸光值A1，并计算吸附率。

1. 6. 3 树脂吸附花色苷泄露曲线的绘制

花色苷溶液以最佳浓度上样于树脂柱，并以最佳流速通过（树脂柱），流出液每10 mL收集1次流份，并测定每个流份的吸光值。若流出液吸光值达到样液吸光值的1/10，则认为此时树脂对花色苷物质的吸附已达到饱和状态，停止上样，并绘制出泄露曲线。

1. 6. 4 上样流速对树脂解析花色苷效果影响的测定

花色苷溶液以最佳浓度上样于树脂柱，并以最佳流速通过（树脂柱）;达到吸附饱和后，利用100 mL最佳体积分数的乙醇溶液、以不同的流速（0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min）进行洗脱，并测定洗脱液的吸光值。

1. 6. 5 笃斯越桔花色苷洗脱曲线的绘制

取20 g预处理后的树脂进行湿法装柱，花色苷溶液以最佳浓度上样于树脂柱，并以最佳流速通过（树脂柱）;达到吸附饱和后，用最佳体积分数的乙醇溶液、以最佳流速洗脱，每10 mL收集1次流份，并测定每个流份的吸光值，绘制洗脱曲线。

1. 6. 6 花色苷得率、回收率和纯度的计算

收集洗脱液，在30 ℃下旋蒸浓缩后冷冻干燥。计算公式[ 2 ]

得率（%）=（纯化样品质量/蓝莓果实质量）×100%

回收率（%）=（实际回收花色苷质量/理论回收花色苷质量）×100%

纯度（%）=（纯化样品中花色苷含量/纯化样品质量）×100%

1. 7 数据统计分析

所得试验数据均以3次测定结果的平均值±标准偏差来表示，利用Microsoft Excel 2007软件和SPSS 16.0进行数据统计分析。图表中标注的不同英文小写字母，表示同一项目的数据结果存在显著差异（p<0.05）。

2 结果与讨论

2. 1 大孔树脂的筛选

大孔树脂对化合物的吸附作用主要是通过分子间的范德华力来实现，其次是氢键，被吸附分子的极性、树脂的极性、大孔树脂的比表面积和孔径等因素都会对吸附效果造成影响。基于花色苷纯化已有的报道，本研究选择了6种效果较好的树脂进行筛选，结果表明，6种树脂对笃斯越桔花色苷的吸附程度和解吸程度存在一定差异（表3）。

对于吸附性能，非极性树脂HPD300和弱极性树脂AB-8的吸附率较高，分别为79.68%和76.56%，可能因为花色苷属于弱极性化合物，同时具有一定的极性和亲水性，所以有利于非极性和弱极性树脂的吸附;其他4种树脂NKA-2、NKA-9、LS-

300b和HPD-100的吸附率相对较低，在70%～74%之间。对于解析性能，弱极性树脂AB-8的解吸率最高，为69.89%;其次是极性树脂NKA-2和非极性树脂HPD-100，分别为59.78%和54.72;而极性树脂NKA-9和非极性树脂HPD-300的解吸率最低，分别为51.74%和51.34%。综合各种树脂的吸附性能和解析性能分析，后续研究均选择AB-8大孔树脂进行笃斯越桔花色苷的纯化。

2. 2 AB-8对笃斯越桔花色苷的静态吸附

理想的树脂不仅吸附速率快、吸附量大，而且具有较好的选择性和较高的解吸速率。大孔树脂AB-8对笃斯越桔花色苷的吸附和解吸动力学曲线（图1）显示，AB-8对花色苷的吸附特点属于快速平衡型，在开始的2.5 h内对花色苷的吸附量呈迅速增加，吸附速率較快;在之后的1.5 h内速率渐缓，约4 h时基本达到平衡。AB-8对花色苷的解吸效果为：在开始的2 h内对花色苷的解吸量不断增加，解吸速率较快;在之后的0.5 h内解吸速率渐缓，约2.5 h时解吸基本达到平衡。

在不同pH值的溶液中，由于花色苷分子存在4种结构形式的比例不同，导致花色苷分子的极性和稳定性也存在较大差异（图2）。pH值对AB-8吸附笃斯越桔花色苷的吸附率具有较大影响，表现为随着pH值的升高，AB-8对花色苷的吸附率逐渐降低，由pH值 1.0时的83.87%下降到pH值 6.0时的72.46%，这是由于花色苷在酸性条件下结构稳定。但pH值为1.0、2.0、3.0时的花色苷吸附率不存在显著差异，由于较低的pH值容易使花色苷的糖基发生水解现象，影响花色苷分子的稳定性，所以选择pH值3.0最适合。

乙醇可以使大孔树脂溶胀，消弱树脂与被吸附分子之间的吸附力，并且可溶解被吸附分子。如图3所示，随着乙醇体积分数的增加，AB-8对花色苷的解吸率也不断增加，解吸率由20%乙醇溶液时的40.23%增加到60%乙醇溶液时的75.75%;但再加大乙醇体积分数，解吸率的变化不大，60%、70%和80%乙醇溶液时的解吸率无显著差异。

2. 3 AB-8对笃斯越桔花色苷的动态吸附

在动态吸附中，上样流速的变化，可以使花色苷分子与树脂接触的时间发生变化，吸附率也会随之改变。图4显示，随着上样流速的增加，AB-8对笃斯越桔花色苷的吸附率呈下降趋势，由流速为0.5 mL/min时的92.78%下降到2.0 mL/min时的82.89%;流速为0.5 mL/min和1.0 mL/min的吸附率没有明显差异，当流速上升到1.5 mL/min时吸附率才显著下降。流速过缓会导致试验周期延长，所以选择1.0 mL/min的上样流速较为适合。

上样浓度也会影响到树脂的吸附效果，样品浓度过高，会导致吸附不完全。图5显示，随着上样浓度的增加，AB-8对花色苷的吸附率呈下降趋势。上样浓度由0.5 mg/mL上升到1.5 mg/mL的过程中，吸附率的变化并不明显，保持在90%以上;当上样浓度为2.0 mg/mL时，吸附率显著下降;上样浓度达到3.0 mg/mL时，吸附率下降到73.56%。综合上述分析，选择1.5 mg/mL的上样浓度较为合适。

AB-8大孔树脂对花色苷的吸附泄漏曲线显示（图6），流出液的吸光值随着上样体积的增加而增加。流出液体积由0 mL到350 mL的过程中，其吸光值的增加幅度较缓;而在流出液体积由350 mL上升到450 mL的过程中，其吸光值的增加幅度明显加大;当流出液体积为400 mL时，其吸光值已达到上样溶液吸光值的1/10，即出现泄漏。

洗脱液的流速也会影响到树脂的解吸效果，如果流速过快，洗脱剂不能与被吸附的花色苷分子充分作用，洗脱的效果就会下降;如果流速过低，则会延长试验和生产周期。如图7所示，随着洗脱流速的增加，洗脱液的吸光值逐渐下降，从流速0.5 mL/min时的0.45，下降到2.0 mL/min时的0.39;但0.5 mL/min和1.0 mL/min的洗脱液吸光值差异不显著，所以选择1.0 mL/min的洗脱流速较适合。

大孔树脂AB-8对笃斯越桔花色苷粗提物的洗脱曲线（图8）显示，利用60%的酸性乙醇溶液可以较好地解吸被吸附的花色苷，洗脱峰较为集中，但同时也存在一定的拖尾现象。当洗脱液为30 mL时，开始检测到有花色苷流出;50 mL时，花色苷的含量达到最高值，此时被洗出的花色苷达到上样花色苷总量的76.33%;洗脱液用去90 mL时，已洗脱出上样花色苷总量的96.33%，即4.5倍柱床体积的60%酸性乙醇溶液基本上可以将笃斯越桔花色苷洗脱下来。经计算，AB-8纯化笃斯越桔果实花色苷的得率为2.12%，回收率为81.63%，纯度为90.11%。有文献记载，采用不同类型大孔树脂对浆果中花色苷的回收率在75%～90%之间[ 3 - 4 ]，与前人的研究相比，本试验对笃斯越桔花色苷的纯化效果较好。

3 小结

3. 1 通过对6种大孔树脂进行筛选，确定AB-8为笃斯越桔花色苷吸附和解吸效果最佳的树脂类型。

3. 2 AB-8对笃斯越桔花色苷的吸附平衡时间为4 h，解吸平衡时间为2.5 h，花色苷粗提物适宜用pH=3的缓冲液配制;解吸时宜采用体积分数为60%的酸性乙醇溶液。

3. 3 动态吸附和解吸的最佳条件为：上样流速 1.0 mL/min，上样浓度1.5 mg/mL，上样体积400 mL;采用90 mL（即4.5倍柱床体积）的60%乙醇溶液，以1.0 mL/min的解吸流速可将花色苷基本洗脱下来。

3. 4 AB-8纯化笃斯越桔果实花色苷的得率为2.12%，回收率为81.63%，纯度为90.11%。

参考文献

[1] Giusti， M.， Wrolstad. R. E. Current Protocols in Food Analytical Chemistry[M]. Hoboken： John Wiley Sons， 2001.

[2] Ma Peng， Y. -F. The extractive technique of red pigment of Bougainvillea Spectabilis Wild[J]. Food Sciences， 2003， 24： 78 - 80.

[3] 李颖畅，马勇，孟宪军，等. 圣云藍莓花色苷的组成分析[J]. 食品与发酵工业， 2009， 35（8）： 129 - 132.

[4] 权静，李冰峰，王益明，等. 大孔树脂分离纯化蓝莓花色苷研究[J]. 粮食与油脂， 2011（8）： 43 - 46.

第1作者简介：勾智丽（1976-），女，高级讲师，主要研究方向：林业科学。

收稿日期： 2019 - 10 - 14