木本植物AGAMOUS-like直系同源基因研究进展

周开颜　徐思远　吴秋亭　石雨　徐启江

摘要：  决定拟南芥花器官发育的关键调节因子AGAMOUS （AG）控制生殖器官的形成和分生组织决定性，与性别分化、开花结果等过程密切相关。然而，尽管对模式植物和一些重要经济植物的AG类基因已有深入研究，但关于木本植物直系同源基因研究还有待拓展。深入探究AG基因在木本植物花发育进程中的调控机制对于林木遗传育种具有重要的指导意义。本文重点阐述了木本植物AG-like同源基因的系统进化和表达模式，并对需深入研究的方向进行了探讨。

关键词：  AGAMOUS-like基因;木本植物;花发育;直系同源基因

中图分类号：   S 535. 2                  文献标识码：   C

基于对模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和金鱼草（Antirrhinum majus）的MADS-box转录因子突变体的研究，提出了被子植物花发育经典的ABC模型，后来逐渐发展为ABCDE模型[ 1 ]。AG是第一个被分离的MADS-box基因，也是拟南芥中唯一的C类基因[ 2 ]，其精细的分子调控机制也一直是植物发育遗传学研究的热点。近年来，随着对木本植物花发育分子机制研究的不断深入，AG-like基因功能多样性的事实表明经典花发育模型中C类基因调控花器官发育具有特异性的观点存在一定局限。

1 裸子植物AGAMOUS-like同源基因系统发育及作用机制

1. 1 裸子植物AGAMOUS-like同源基因系统发育

AG出现在裸子植物和被子植物分化之前，在随后3亿年的进化过程中其功能具有一定保守性。黑云杉（Picea mariana） SAG1在拟南芥中异源表达，可引起萼片向心皮、花瓣向雄蕊的同源转换的事实表明：控制被子植物花发育和裸子植物孢子叶球发育的遗传途径具有同源性[ 3 ]。罗汉松（Podocarpus reichei）与红豆杉（Taxus globosa）的AG直系同源基因PodAG和TgAG与DAL2具有同源性， 但它们的表达模式不同， 表明紫杉科植物的假种皮与松科植物的珠鳞及罗汉松科植物的肉质鳞被是不同类型的器官。

AG亞家族基因调控种子植物生殖器官发育的功能存在保守性，不同物种AG基因的表达模式不同可使其生殖器官形态差异显著。系统发育分析表明，杉科植物日本柳杉（Cryptomeria japonica）的CjMADS4、柏科植物罗汉柏（Thujopsis dolabrata）的TdMADS3、欧洲刺柏（Juniperus communis）JcMADS2属于MIKC-型MADS-box基因家族的AG进化枝，与其他裸子植物的AG类基因例如DAL2、GBM5、GGM3和CyAG聚为一支。但松科和柏科的AG直系同源基因的不同表达模式说明，松科的珠鳞与柏科的种子球果不具有形态同源性，TdMADS3和JcMADS2在种子球果发育晚期时的不育苞片中表达，印证了这些基因可能获得了新功能[ 5 ]。

1.2 裸子植物AG作用机制

AG基因在裸子植物的生殖器官中表达，将辐射松（Pinus radiata） AG同源基因PrAG1部分结构域敲除并在烟草中异位表达，35S：：MI转基因烟草株系产生花序结构变化和雄性不育特征，使花粉和种子形成减少，但花序分枝和花数量增加，这为通过转基因获得雄性不育株系提供了思路和途径。

银杏（Ginkgo biloba）的AG类基因在肉质果实的发育和成熟过程中表达。异位表达银杏AG基因的番茄，其萼片在近端连接，并伴随着果实的发育和成熟逐渐变得更厚，出现黄橙色表型，说明它们经历了向心皮样结构的同源性转变。表明裸子植物基因不仅具有调控雌性生殖器官发育的C功能，而且还可能与其他基因共同调控果实发育[ 7 ]。

2 被子植物AGAMOUS-like同源基因系统发育及表达模式

2. 1 木本被子植物AG同源基因的系统进化

在AG基因家族进化过程中发生了2次主要的基因重复事件，其中一次发生在被子植物和裸子植物分化之后，被子植物进化的早期，产生了C进化系和D进化系;另外一次发生在C进化系，蔷薇类和菊类分化之后，产生了euAG和PLE进化系。基因表达或编码序列的变化可以获得亚功能化或新功能化保留的重复基因，有助于生物体的遗传稳定性和多样性。

从蔷薇科的核心属植物太行花（Taihangia rupestris）中分离出TrAG和TrSHP两个MADS-box基因，分别是euAG和PLE谱系的进化枝成员。原位杂交分析表明，二者主要在雄蕊、心皮和胚珠中表达。当首先观察到雄蕊原基时，TrAG最初在花分生组织区域中表达，后启动雄蕊和心皮。而在这个发育阶段没有观察到TrSHP信号。在心皮发育的晚期阶段，TrAG在胚珠、子房以及发育中的柱头中被检测到表达，TrSHP表达仅限于胚珠，35S：：TrAG和35S：：TrSHP的转基因拟南芥植株分别表现出相似的表型。此外，转基因35S：：TrSHP拟南芥花被脱落受到抑制。酵母双杂交测定表明TrAG可以与TrSEP3相互作用，而TrSHP不能。说明在真双子叶植物中euAG和PLE谱系补偿方式不同，euAG和PLE旁系同源物TrAG和TrSHP可能通过表达模式的改变和编码区域中的积累变化而具有亚功能或新功能[ 8 ]。

棕榈亚科植物Ptychospermatinae总是形成不同大小的花序。然而，从进化的角度来看，它们在雄蕊数量方面表现出很大的差异（几个到几十个甚至几百个）。使用AGAMOUS作为5个核标记之一和3个叶绿体标记（matK序列，ndhA和RPS15-ycf1）相结合，提出了一种新的进化亚族假说，确定了4个主要分支[ 9 ]，各分支成员的雄蕊数量存在差异。

2. 2 木本被子植物AG同源基因表达调控

木本植物尤其是多年生木本植物，从营养生长到生殖生长的过渡，需要经过反复的季节性变化和替代性增长之后才会发生，其调控自身开花和果实发育的机制也更为复杂。对于桃（Prunus persica）的C类器官特征基因PPERAG在不同组织以及果核硬化过程中果实果皮中的表达模式、序列结构和系统发育分析表明：PPERAG基因参与桃花和果实发育，并且在多年生木本树木中的作用与在模式植物中的功能相容[ 10 ]。原位杂交显示与拟南芥AG同源的欧洲白桦（Betula pendula Roth） BpMADS6基因在心皮，胚珠和雄蕊中表达，但不在花被片或鳞片中表达。在一些转基因桦树植物中，35S：：BpMADS6正义或反义构建体导致花被片数量增加并且在一些雄性花序中完全缺乏雄蕊。这表明BpMADS6参与花的形成，并且和AG的功能同源[ 11 ]。

广玉兰（Magnolia grandiflora）种子发育后期，涉及外种皮软化和颜色变化的相关基因表达，其中包括AG基因[ 12 ]。红花玉兰（Magnolia wufengensis） MwAG基因仅在雌雄蕊中表达，在幼叶、外轮花被和内轮花被中不表达。在花器官形态分化过程中，MwAG基因在雌雄蕊原基分化期和成熟期均维持在一个较高水平，且在雄蕊中的表达波峰早于雌蕊，这与雌雄蕊形态分化的时间基本吻合;在花芽分化早期，相同大小的花芽，瓣数越多，MwAG基因在雌雄蕊中的表达量越低，其结果与不同瓣数雌雄蕊分化的时间一致，即瓣数越多，雌雄蕊分化越晚[ 13 ]。黄金树（Cat alpaspeciosa） AG同源基因CaspAG在花发育过程中同样仅在雄蕊和雌蕊中表达，而在茎、叶片、萼片和花瓣中几乎不表达。实时荧光定量PCR分析结果表明：CaspAG基因在雌雄蕊原基分化期至雌雄蕊成熟期均有表达，在雌雄蕊发育成熟期表达量达到最高;且在雄蕊中表达高峰的时间明显早于雌蕊，这与雌、雄蕊形态成熟的时间也基本吻合。与红花玉兰的表达模式基本相似[ 14 ]。

石榴（Punica granatum）在胚珠发育停止的关键阶段，显示出了功能性雄花（function male flower，FMF）和双性花（bisexual flower，BF）之间AG类同源基因（Gglean028014，Gglean026618和Gglean028632）表達模式的差异[ 15 ]。马兜铃（Aristolochia fmbriata） C类基因AfmSTK的时空表达限于雄蕊，子房和胚珠，表明了保守的雄蕊和心皮同一性功能，与核心真双子叶和单子叶植物中报道的一致。此外，AfmSTK在器官脱落和开裂区的表达可能与其衰老过程有关[ 16 ]。麻疯树（Jatropha curcas）中20多种AGAMOUS类转录因子均有助于雌性花胚囊发育[ 17 ]，且qRT- PCR结果表明AG类基因在麻疯树（Jatropha curcas）的雄花和雌花中表达水平较高[ 18 ]。

在香蕉（Musa nana）花和果实提取物中发现的一种CArG-box序列结合AG蛋白的DNA-蛋白质互作现象表明AG因子参与香蕉果实成熟和花卉生殖器官发育[ 19 ]。AGAMOUS类转录因子的bHLH结构域在番木瓜（Carica papaya）胚性愈伤组织中促进次生代谢产物尤其是苯丙氨酸的合成，进而促进其胚性愈伤组织的分化和体细胞胚的发生[ 20 ]。

甜樱桃（Prunus avium） AG亚家族基因PaMADS5在花的雄蕊和心皮中表达，但表达量受赤霉素的影响，随着赤霉素处理浓度的升高，PaMADS5的表达逐渐升高[ 21 ]。AG也是藤本植物葡萄（Vitis vinifera）簇紧密化的关键基因，因为它影响了赤霉素基因的表达，导致簇长度和浆果大小增加[ 22 ]。

毛果杨（Populus trichocarpa） AG直系同源基因PTAG2的第二内含子与最小35S启动子序列融合创建出两个人工启动子fPTAG2I （PTAG2内含子序列的正向）和rPTAG2I （PTAG2内含子序列的反向取向），由rPTAG2I启动子驱动表达白喉毒素A （DT-A）基因的转基因烟草在温室条件下产生了无花，中性（无雄蕊和无心皮）和无心皮3种花粉消融表型，这些转基因品系的营养生长类似于野生型植物的营养生长，rPTAG2I人工启动子在营养组织和器官中没有可检测的活性，即rPTAG2I：：DT-A基因可产生保持正常营养生长的无花杨，这一无花果性状对于防止花粉和种子介导的转基因流动具有重要意义[ 23 ]。研究者还发现，毛果杨（Populus trichocarpa）转录区“基因体甲基化”的基因甚至比启动子甲基化的基因表达量低，即基因体甲基化对转录的抑制作用比启动子甲基化更强，且在雄性柔荑花序中，基因体甲基化比启动子甲基化更频繁。这一结论说明：在表观水平上存在一个更加新颖的策略调控被子植物柔荑花序的发育[ 24 ]。AGAMOUSlike2基因对于解除樱桃（Prunus pseudocerasus）休眠也显示出显著的表观遗传作用[ 25 ]。

3 AG同源基因与重瓣花表型效应

对于星花木兰（Magnolia stellata） AG直系同源基因MastAG，mastag 2和mastag 3表达分析表明：三种选择性剪接亚型仅在发育的雄蕊和心皮中表达，MastAG的功能类似内源AG，可确定心皮的身份，mastag 2和mastag 3关键域或子域缺失导致C功能的丧失。然而，在拟南芥中异位表达mastag 2产生的花萼片转变为心皮，但没有花瓣和雄蕊，而异位表达mastag 3的株系类似于花突变体表型，并产生双花。说明星花木兰（Magnolia stellata） AG直系同源基因的表达变化可导致花瓣数量增加的“重瓣花（double-flower）”表型[ 26 ]。

上臈杜鹃（Tricyrtis macranthopsis）的雄蕊和心皮转化为花瓣状器官也与AG同源基因TrimAG的表达有关，但基因组DNA的Southern印迹分析表明，双花期品种和野生型之間没有显着差异。启动子和AG内含子II序列的分析未鉴定双重花期栽培品种中的任何关键突变序列，于是Ahmad等[ 27 ]猜想第3轮和第4轮中TrimAG表达降低可能是由于AG表达或转录沉默调控网络中的一个基因发生突变，引起该网络中的TrimAG启动子/内含子序列甲基化， 即该突变影响了杜鹃发育的表观遗传调控。

玫瑰（Rosa hybrida） C功能基因的同源物RhAG的沉默与低温促进玫瑰花瓣数量增加的表型相似。低温提高了原本高甲基化的RhAG启动子的甲基化水平，限制了雄蕊中RhAG的表达 [ 28 ]。

4 展 望

MADS-box基因对花发育的调控机制一直是近些年分子发育生物学研究的热点，随着AG类基因在模式植物以外的一些木本植物中表达调控模式的逐渐清晰，也迎来了更多未知的问题，同时也使AG研究领域变得更宽。

以山茶花（Camellia japonica）为研究材料，通过转基因途径对家族类基因的功能研究发现，C类基因CjAG1可以调控雄蕊及花瓣的发育，这种表达特征与植物花器官发育模型中类基因的表达特征完全不符[ 29 ]。以苹果（Malus domestica）各组织为研究材料，通过研究类基因的表达特性[ 30 ]，说明MdMADS15基因不仅在苹果的生殖器官中表达同时在苹果的叶片以及叶芽中也表达。AG基因的表达也能够在梅（Prunus mume）的萼片检测到[ 31 ]。

此外，茶树（Camellia sinensis） CSAG基因在转基因烟草株系的雄蕊中的表达低于雌蕊或与雌蕊齐平，花瓣颜色变成了浅粉色，并且茶树花芽的和盛花期的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊以及茶树幼果和芽叶中都有表达，但各组织中的表达程度不同[ 32 ]。原位杂交研究显示，茶树（Camellia sinensis） AG类基因只是在花芽形成之后，雄蕊和心皮起始前，在第3和第4花轮具有较强的表达，它并不干扰植物的正常营养生长[ 33 ]。以上研究均说明：AG类基因在木本植物中的表达调控机制远比我们想象中的复杂得多，很可能是多条途径综合作用的结果，详尽的机制还需更进一步研究。

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The Research Progress of AGAMOUS-like Orthologous

Genes in Woody Plants

ZHOU Kaiyan

（College of Life Science， Northeast Forestry University，   Heilongjiang Harbin 150040）

Abstract AGAMOUS（AG）， the key regulator of floral organ development in Arabidopsis， controls the formation of flower reproductive organs and the decisive nature of meristems， and is closely related to the processes of plant sex differentiation and flowering. However， there are in-depth study of AG-like gene in model plants and some important economic plants， the research of AG-like orthologous genes in woody plants remains to be expanded. It has important guiding significance for forest genetic breeding to explore the regulation mechanism of AG-like gene deeply in the flower development process in woody plants. This article focuses on the systematic evolution and expression patterns of some AG-like homologue genes in woody plants， and discusses the direction for further research.

Key words AGAMOUS-like;  Woody plants;  Flower development;  Orthologous genes