96 个大白菜品种根肿病抗性鉴定及位点检测

魏小春，原玉香，赵艳艳，杨双娟，王志勇，苏贺楠，李军党，李 林，牛刘静，张晓伟

（1.河南省农业科学院园艺研究所 郑州 450002； 2.郑州大学农学院 郑州 450001）

大白菜原产于中国北方，是我国重要的露地蔬菜，素有菜中之王的美称。根肿病是由鞭毛菌亚门芸薹根肿菌（Woron）侵染引起的土传病害，在许多国家都有发生。根肿菌通过感染十字花科植物的根部，使之形成肿瘤或腐烂，最终导致整株植物枯萎甚至死亡。

随着大白菜根肿病逐年加重，化学、生物及农业措施在防治根肿病中的效果呈下降趋势。从生态环境方面考虑，培育抗病品种将是解决根肿病的有效方法。目前，在大白菜和欧洲芜菁上已定位了32 个抗根肿病位点：、、、、、、、、等。研 究 较 多 的 是、、、、、位点。其中，、和CRb抗病基因已成功克隆且都为TIR-NB-LRR 类抗病基因。抗病基因的克隆和抗病位点的鉴定为培育更好的大白菜抗病品种提供了依据。河南省新野县大白菜种植面积较大，其面临根肿病的困扰日益严重，目前主要的根肿病菌株是4号生理小种新野新菌和新野老菌。在本研究中，笔者利用新野老菌及新野新菌病原菌对96个大白菜材料进行接菌鉴定，同时，利用已报道的、、、、、等6 个标记对大白菜品种进行抗性位点检测，明确不同位点与根肿病抗性的关系，进而为选育抗根肿病大白菜资源提供分子标记基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2020 年9—11 月在河南省新野县河南省农业科学院园艺研究所叶类蔬菜研究室根肿病原圃开展试验，根肿病菌株分为新野老菌4 号生理小种和新野新菌4 号生理小种，96 份大白菜材料由河南省农业科学院园艺研究所叶类蔬菜生物育种课题收集保存（表1）。

表1 供试的96 个大白菜品种

续表1

1.2 方法

试验材料的种植及鉴定均在河南省农科院园艺所新野县根肿菌病原圃进行，其中AKIMEKI 为抗病对照，Chiifu 和ECD05 为感病对照，每份大白菜品种种植36 棵。笔者采用苗期穴盘人工接种鉴定方法，设置了3 次重复，制备1×10个·mL的根悬浮液，并使用灌根法在播种当天及播种后第3天进行接菌处理。30 d 后，开始对每株材料根部发病程度进行分级调查记录发病情况，并利用、、、、、等6 个抗根肿病位点标记进行基因型鉴定。

1.3 根肿病抗病性鉴定及病情分级

试验材料接菌处理30 d 后调查发病情况，计算病情指数，评价品种的抗性。大白菜根肿病的鉴定标准如下（表2）。

表2 大白菜根肿病发病级别鉴定标准

病情指数（DI）和病株率的计算公式如下：

病情指数=［Σ（各级病株数×相应级别）/（调查总株数×发病最高级别代表值）］×100。

病株率=（病株数/调查株数）×100%。

病情指数的划分标准为：高抗≤30.0；30.0＜抗病≤40.0；40.0＜低抗/低感≤50.0；50.0＜感病≤80.0；高感＞80.0。

1.4 根肿病抗病基因检测

使用改良后的CTAB 法提取大白菜基因组DNA，PCR 反应总体积为20 μL，根肿病抗病位点、、、、、引物、PCR 体系及反应条件见表3。

表3 各个引物PCR 反应程序要求

2 结果与分析

2.1 大白菜品种抗病性鉴定

根据苗期接菌发病情况，将96 份大白菜划分为3 种不同的抗性类型：抗新野老菌和新野新菌类型，抗新野老菌不抗新野新菌类型，不抗新野老菌和新野新菌类型。其中抗新野老菌不抗新菌品种的比例高达61.46%，分别为秋利皇、金锦、CR-启航等59 个品种；抗新野老菌和新野新菌品种比例为33.33%，分别为山地王2 号、灿光CR-65、冬福春宝等32 个品种；不抗新野老菌和新野新菌品种比例为5.21%，分别为吉红娃娃、德高荣耀、玲珑二号等5 个品种（表4）。

2.2 大白菜品种抗病基因型鉴定

利用、、、、、等6 个根肿病抗病位点分子标记对96 个大白菜品种进行抗病基因型鉴定，琼脂糖凝胶检测结果如下（表4）：：57 个品种检测到抗性位点，占全部材料的59.38%；：60 个品种检测到抗性位点，占全部材料的62.50%；：20 个品种检测到抗性位点，占全部材料的20.83%；：14 个品种检测到抗性位点，占全部材料的14.58%；：50 个品种检测到抗性位点，占全部材料的52.08%；：4 个品种检测到抗性位点，占全部材料的4.17%。部分琼脂糖电泳结果见图1 所示。

图1 24 个大白菜品种基因位点的琼脂糖凝胶电泳结果

不同大白菜品种的抗病位点存在较大差异，供试的96 个品种中CR 相春、春美二号、天香65 未检测到抗病位点；Chiifu、宝根王（北京）、胜根CR1、根白金、西由铁根605 检测到抗病位点；CR 根宝、天籁、文鼎春宝、胶研CR65 检测到抗病位点；春美一号、金童四季、宝根王（韩国）、申荣八号、CR-578、韩峰、春锦检测到抗病位点；山地王2号B 型，CR 冬圣检测到抗病位点，这类只检测到单一抗病位点或者未检测到抗病位点的材料约占全部材料的21.88%。AKIMEKI、CR 白菜12-101、CR-元春等57 个品种同时含有，抗病位点，约占全部材料的59.38%。同时这57 个品种的一部分又检测到抗病位点（如希望白菜F），抗病位点（如农科一号），抗病位点（如金锦）；另有18.74%的品种同时包含、抗病位点（如西由铁根CR108）或者、抗病位点（如西由铁根705）。96 个大白菜品种大多能检测到2 至4 个抗病位点，其中CR 春福含有的抗病位点最多，包含5 个，分别是、、、、（表4）。笔者推测含有较多抗病位点的品种在理论上会对多个根肿病生理小种表现抗性，对单一生理小种的抗性也会更强。

表4 96 个大白菜品种分子标记鉴定及病情指数分析

续表4

3 讨论与结论

大白菜抗病与感病性状与所含抗病基因具有一定的对应关系，目前，在大白菜和欧洲芜菁上已定位32 个抗根肿病位点：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、Rcr9、、、、、、、、、、、CRb。虽然已经发现了几十个抗病位点，但是目前研究较深入的就只有、、、、和这6 个抗病位点。其中，、、、这4 个抗性位点对4 号生理小种具有抗性。

本次试验中农科一号、山地王1 号、春美一号、春美二号、山地王2 号、山地王2 号B 型、灿光CR-65（原名星光白菜）、宝根王、BDA202、余庆、春盛CRR、冬福春宝、金童四季、改良金童春秋、BCC-515、寒玉90、申荣8 号、CR 春泰、CR 春福、胜根CR1、根白金、CR 皇春3 号、早春の大将、屠龙CR、CR 春美609、韩峰、怀春、天籁、春锦、奇山抗根56、小黄龙等31 个品种对新野老菌和新菌均表现出抗性，这些材料大多含有和抗病位点，个别品种含有、、或抗病位点。可以看出和基因对于品种抵抗新野老菌和新菌很重要。而含有抗病位点的大白菜品种如Chiifu、德高荣耀、吉红娃娃、玲珑二号对新野老菌和新菌却表现出感病症状，笔者推测基因可能不是主要的抗病基因。前人研究发现，由于田间存在多致病型生理小种，且随着生理小种菌源的变异，很多具有抗性位点的抗病大白菜品种的抗性也在迅速丢失。在本次试验中秋利皇、金锦、CR-启航等59 个品种只抗新野老菌而不抗新菌，发生抗性丢失的现象，且所占比例高达61.46%。对品种进一步检测发现只含有位点的山地王2 号B 型却对新野老菌和新菌都表现出抗性，说明在该材料中可能含有新的抗病基因。

分子标记检测结果可以从理论上揭示品种抗病的原因。笔者通过对96 个大白菜品种进行苗期抗性鉴定和抗性位点检测，发现大白菜品种中含有较多抗性位点的品种，如AKIMEKI、冬福春宝、改良金童春秋等对新野老菌和新菌都表现出抗病，笔者推测含有较多抗病位点的品种在理论上会对多个根肿病生理小种表现抗性，对单一生理小种的抗性也会更强。下一步，笔者将进一步利用已报道的根肿病抗病位点，依据现有的种质资源，进一步鉴定出具有多根肿病抗性位点的品种，筛选出具有高抗病性，对生理小种抗性持久的育种材料。

笔者通过对96 个大白菜品种进行根肿病抗性鉴定和抗根肿病位点检测，发现含有，和抗病位点的材料对新野老菌和新菌均表现出抗性，但只含有和抗病位点的大白菜品种对新野老菌或新菌却表现出感病症状，笔者推测和或许不是主要的抗病位点。另外笔者发现只含有位点的山地王2 号B 型却对新野老菌和新菌表现出抗性，说明其可能含有新的抗病基因。研究结果为大白菜抗根肿病种质资源鉴定以及大白菜抗根肿病育种奠定了材料基础。