不同改良措施对设施芹菜根际土壤微生物群落结构的影响

付宽宽，王小兵，汪晓丽，陈 悦，程 通

（扬州大学环境科学与工程学院 江苏扬州 225127）

随着我国社会经济的高速发展和农业产业结构的优化调整，我国设施农业也迎来了高速发展期。其中，设施蔬菜生产更是从粗放型逐渐向集约型转变。因为设施蔬菜种植环境的密闭性和模式的单一性，导致设施蔬菜连作现象严重，很容易出现土壤质量退化和土传病害发生严重等问题。

我国将通过碳源和淹水结合的方式创造厌氧环境杀死土传病害来改善土壤连作障碍的方法叫做强还原土壤灭菌法（Reductive Soil Disinfestation，RSD）。RSD 方法的特点是将易分解的碳源和灌溉结合，刺激好氧菌的快速生长，加快土壤中氧气的消耗，厌氧环境使土壤菌落结构从以好氧菌为主转变为厌氧菌或者兼性厌氧菌为主。在厌氧环境下，微生物发酵产生的代谢有毒物质可进一步对病原菌起到抑制作用。施用土壤改良剂（石灰氮等）是新兴起的一种快速恢复土壤退化的方法，相比传统方法具有方便快捷和经济高效的特点。石灰氮改良机制是水解后生成氰氨，对土壤病原菌有灭杀作用，氰氨还可以水解形成可被植物直接吸收利用的尿素或氨。它的优势是水解过程无酸根残留，不会导致土壤酸化加重。土壤微生物群落失衡是导致土传病害发生的直接原因，土壤微生物群落的结构组成是衡量土壤健康情况的重要指标。有研究表明，土壤微生物群落结构与土壤理化性质、施肥方式、土壤质地等有关。目前，研究微生物的方法很多，高通量测序技术因具有检测信息丰富、准确率高和成本较低等优点被广泛应用。

芹菜作为我国深受欢迎的伞形科多叶植物，具有广泛的种植面积。但在设施栽培条件下，芹菜常因次生盐渍化、病虫害发生等问题导致减产严重。针对芹菜连作障碍，国内通常采取施用石灰氮等改良剂、芹菜合理间作等治理方式。莫娟等研究表明石灰氮能有效防治芹菜根腐病的发生。袁涛等通过菜豆、芹菜间作来提升芹菜的产量和品质。然而，基于Illumina Miseq 高通量测序技术分析不同改良措施对连作芹菜土壤微生物群落结构影响的研究较少。笔者通过灌水高温闷棚联合施用有机物或石灰氮的处理措施来缓解芹菜土壤连作障碍，改善土壤微生物群落结构，以期为缓解芹菜连作障碍和提高芹菜产量提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

蔬菜大棚位于江苏省太仓市三市村。太仓市处于地势平坦的平原地区，地势自东北向西南倾斜，属于北亚热带南部湿润气候区，光照充足，夏季炎热多雨，冬季寒冷少雨，7 月平均气温为27.7 ℃，1 月平均气温为2.8 ℃，年平均气温为15.3 ℃。太仓市年平均降水量为1017 mm，年平均降雨日为130 d，太仓市全年受到的日照时长可达4 423.7 h。试验前供试土壤的基本理化性质测定结果：pH 值为5.94、全氮含量（，后同）为0.53 g·kg、有效磷含量为72.7 mg·kg、有机质含量为22.1 g·kg、硝态氮含量为100 mg·kg、电导率为68 mS·m。

1.2 材料及试验设计

供试材料：芹菜（）品种为美国西芹文图拉，由北京思贝奇种子有限公司提供。有机物料（麦糠）、石灰氮［（总氮）≥21%，（氰氨化钙）≥55%］由山东金耐特环保科技有限公司提供；前茬作物：大蒜；棚龄：5 年。

在试验中共设计8 个处理，（1）CK，裸地；（2）CW，灌水高温闷棚；（3）O1W，灌水高温闷棚+5000 kg·hm麦糠；（4）O2W，灌水高温闷棚+10 000 kg·hm麦糠；（5）O3W，灌水高温闷棚+15 000 kg·hm麦糠；（6）S1W，灌水高温闷棚+300 kg·hm的石灰氮；（7）S2W，灌水高温闷棚+600 kg·hm的石灰氮；（8）S3W，灌水高温闷棚+900 kg·hm的石灰氮。每个试验小区长9 m，宽3 m，面积27 m，小区间隔25 cm，随机区组设计，3次重复。将不同用量的麦糠或石灰氮均匀撒在对应的试验小区，用旋耕机将麦糠和石灰氮深翻入土，然后在小区四周做小拱，拱宽20 cm、高30 cm，在小拱上覆盖一层塑料薄膜，对小区进行灌水处理让土层处于淹水状态。在试验小区表面覆盖一层塑料薄膜，密封大棚25 d 后揭棚排水，通风5 d 晾干土层，翻耕土壤后即可进行芹菜播种。每个小区种植大约500 株芹菜，株距大约为20 cm。2019 年8 月5 日施用基肥：尿素375 kg·hm、有机复合肥1200 kg·hm、磷肥225 kg·hm、钾肥150 kg·hm。为保持氮素平衡，灌水高温闷棚联合石灰氮处理措施不施用尿素。在植株生长旺盛期追肥，施用量为复合肥225 kg·hm、尿素75 kg·hm、钾肥30 kg·hm。

1.3 土壤样品的采集

在芹菜收获期用五点取样法采集深度为20 cm的根际混合土样。采样时间为2019 年11 月11 日，将土样分为2 份，1 份保存于-70 ℃的超低温冰箱用于土壤根际微生物分析（混合样本，不设重复）；1份风干后去除杂物，研磨、过筛后保存。

1.4 测定方法

1.4.1 土壤微生物群落、基本理化性质和产量的测定 土壤理化性质按照指定标准测定，土壤有机质含量采用重铬酸钾容量法（NY/T 1121.6—2006）测定，硝态氮含量采用紫外分光光度法（GB/T 32737—2016）测定，pH 值采用电位法（HJ 962—2018）测定，电导率采用电极法（HJ 802—2016）测定，有效磷含量采用紫外分光光度法（NY/T 1121.7—2014）测定，全氮含量采用半微量开氏法（NY/T 53—1987）测定。在芹菜收获期，采摘每个小区的芹菜分别计产，并计算各处理芹菜产量平均值。

1.4.2 土壤细菌16S rDNA 基因序列的扩增 使用引物：515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和907R（5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’）对细菌16S rDNA 基因序列V4～V5 可变区进行扩增。PCR 反应体系（20 μ L）如下：5 × 高保真缓冲液4 μ L，2.5 mmol·LdNTPs 2 μ L，正反向引物（5 μmol·L）各0.8 μL，高保真DNA 聚合酶0.4 μL，DNA 模板10 ng，补加ddHO 至20 μL。PCR 反应程序为：95 ℃2 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，25 个循环；72 ℃5 min。从2%琼脂糖凝胶中提取扩增产物送至凌恩生物科技有限公司（上海）完成测序。

1.5 数据分析

首先对原始数据进行质控过滤，然后将正反向reads 配对，并剔除有问题序列以及嵌合体，构建物种分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU）丰度表（97%相似度）。基于OTU聚类分析结果，对OTU 进行多种多样性指数分析。利用Mothur 做rarefaction 分析，利用R 语言工具制作曲线图。以OTU 的物种分类结果为依据，在门的分类级别上对8 组土壤样品中细菌的组成和结构以及相对丰度进行分析，并利用R 语言工具作图。土壤理化性质等采用Microsoft Office Excel 2016、SPSS statistics 21 进行数据统计分析，采用邓肯氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同改良措施对根际土壤理化性质的影响

分析不同的改良措施对芹菜根际土壤理化性质的影响。由表1 可知，经改良措施后土壤pH值显著提高，O3W 处理达到峰值6.78，比CK 增加了14.1%；土壤全氮含量在灌水高温闷棚联合有机物或石灰氮措施中均显著提高，S3W 处理达到峰值0.80 g·kg，比CK 增加了45.5%；土壤有机质含量在灌水高温闷棚联合有机物措施中显著提高，O3W 处理达到峰值34.4 g·kg，比CK 增加了43.9%；土壤有效磷含量在灌水高温闷棚联合有机物和石灰氮措施中均显著提高，O3W 处理达到峰值为87.3 mg·kg，比CK 增加了20.1%；电导率值在灌水高温闷棚联合有机物措施中显著降低，O3W 处理最小，为30 mS·m，比CK 降低了49.2%；土壤硝态氮含量在灌水高温闷棚联合石灰氮措施中显著降低，S3W 处理最低，为49.0 mg·kg，比CK 降低了40.7%；土壤容重经改良措施后显著降低，S3W 处理最小，为1.05 g·cm，比CK 降低了19.8%。

表1 不同处理对根际土壤理化性质的影响

2.2 不同改良措施对芹菜产量的影响

由图1 可以看出，灌水高温闷棚联合有机物或石灰氮对芹菜产量有不同的影响。芹菜产量在O2W、O3W 和S3W 处理中提升最显著。O2W、O3W 和S3W 处理芹菜产量分别为93.4、95.3、90.4 t·hm，与CK 相比分别提高了34.6%、37.3%和30.2%。O1W、S1W 和S2W 处理芹菜的产量显著高于CK。CW 处理芹菜的产量高于CK，但差异不显著。灌水高温闷棚联合有机物处理措施中，O3W 处理效果最好；灌水高温闷棚联合石灰氮处理措施中，S3W 处理效果最好。

图1 不同处理下芹菜的产量

2.3 不同改良措施下芹菜根际土壤的测序结果分析

利用Illumina Miseq 测序分析平台对土壤微生物，细菌16S rDNA 基因序列V3～V4 区进行测序，共得到有效序列355 836 条，序列碱基数147 858 249 bp，平均长度为415.44 bp（表2）。稀释性曲线可以用来比较不同样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。由图2 可知，在相似度97%条件下，所有土壤样品稀释性曲线均趋于平缓，表明样本测序数据量有较高的可信度，能够比较真实地反映不同处理间土壤样本的微生物群落状况。

表2 不同处理根际土壤的有效序列数

图2 不同样本的稀释性曲线图（相似度97%）

2.4 不同改良措施对根际土壤微生物群落的影响

2.4.1 不同处理下根际土壤微生物的物种分类单元（OTU）数 基于OTU 丰度的样本聚类图（图3）。观察各处理共有的OTU 数为443 个，OTU 总数和特有的OTU 数分别是CK（1821，155）、CW（2045，153）、O1W（2575，167）、O2W（2609，203）、O3W（3148，361）、S1W（2656，167）、S2W（2483，181）、S3W（2900，334）。可以看出，O3W 处理的OTU 总数和特有的OTU 数都是最多的，分别为3148 和361，说明该区域不仅含有更多的微生物种类，也含有较多的特有微生物种类。

图3 基于OTU 丰度的不同样本的聚类图

2.4.2 不同处理下土壤微生物门水平群落结构 由图4 可知，在门水平分类上，不同处理间微生物的主要菌门分别为：变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteriota）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、蓝藻门（Cyanobacteria）、棒状杆菌门（Rokubacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）。灌水高温闷棚处理措施对土壤微生物相对丰度的影响较小；灌水高温闷棚联合有机物处理措施使变形菌门和拟杆菌门的相对丰度提高，而放线菌门、厚壁菌门和酸杆菌门的相对丰度降低；灌水高温闷棚联合石灰氮处理措施提高了厚壁菌门和放线菌门的相对丰度，降低了变形菌门的相对丰度。

图4 细菌群落在门水平上的相对丰度结构

2.5 不同改良措施下根际土壤微生物的多样性分析

2.5.1 样本多样性分析（Alpha-diversity，Alpha）从Alpha 多样性分析可知（表3），经过改良措施后，芹菜根系土壤微生物的丰富度指数（Chao1 指数）和多样性指数（Shannon 指数）都有显著提高。以O3W 处理的Chao1 指数和Shannon 指数最高，分别为4 281.7、6.903 7，这说明O3W 处理的微生物数量和种类都相对较多。Simpson 值代表的是微生物的优势度指数，CW 处理Simpson 值最高为0.018 4，说明其微生物群落中菌种的分布不均匀、多样性较差、优势种比重大。Coverage 指数越高说明土壤样本序列被测出的概率越高，在试验中各土壤样本指数都在0.9 以上，代表可以反映样本中微生物群落的真实情况。

表3 不同处理根际微生物多样性的变化

2.5.2 样本间比较分析（Bate-diversity，Bate） 由图5 可知，采用主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCOA），以两坐标轴的零基准线为参考系，CK 和CW 处理距离PC2 较近，说明PC2 主成分对其影响较大，占菌落总影响的16.74%。O1W、O2W和O3W 处理距离PC1 和PC2 都比较近，说明其菌落结构受PC1 主成分和PC2 主成分影响都比较大，分别占总影响的49.91%和16.74%。S1W、S2W 和S3W 处理距离两坐标轴比较远，说明其受两主成分的影响不大。CK、灌水高温闷棚、灌水高温闷棚联合有机物、灌水高温闷棚联合石灰氮4 种不同处理措施在主坐标分析图上大致分布在4 个方位，说明不同处理措施间有明显差异。

图5 Bate 多样性的主坐标分析

2.6 土壤的主要理化性质与微生物群落的关系

对土壤样本进行亢余分析（RDA）可知（图6），第一坐标轴可以解释74.27%的信息值，第二坐标轴可解释16.90%的信息值，两坐标轴的总解释达到91.17%的信息值，可准确反映样本的实际情况。各处理点位分散于不同的象限空间内，说明不同处理间微生物群落的差异明显。可以看到，硝态氮是影响土壤细菌群落的主要理化性质之一。硝态氮与CK 和CW 处理呈正相关，与灌水高温闷棚联合有机物处理措施的相关性不明显，但与灌水高温闷棚联合石灰氮处理措施以及放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门呈负相关。pH、有机质、有效磷等与CW 处理和绿弯菌门、疣微菌门呈负相关，与灌水高温闷棚联合有机物或石灰氮处理措施以及放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门呈正相关。

图6 土壤理化性质与细菌群落的关系

3 讨 论

已有研究表明，单纯对连作土壤进行淹水处理并不能有效灭杀土壤病原菌，而淹水联合有机物料的处理措施却能取得显著效果。在连作土壤中单纯施用石灰氮取得的灭菌效果可能会受温度的影响，而灌水高温闷棚联合石灰氮的处理措施却能有效发挥石灰氮的灭菌效果。笔者以灌水高温闷棚联合有机物或石灰氮等改良措施来改善芹菜连作障碍，优化土壤微生物的群落结构。经灌水高温闷棚联合石灰氮处理后，土壤的pH 值显著提高、硝态氮含量显著降低，这与张蕾等和OH 等的研究结果相同。在灌水高温闷棚联合石灰氮处理措施中，硝态氮的降低可能是因为石灰氮水解生成的双氰胺，对微生物的硝化反应产生了抑制作用。施用石灰氮后土壤全氮含量显著提升，这与Xiao 等的观点一致。灌水高温闷棚联合有机物处理措施提高了土壤的有机质、全氮和速效磷含量，可能是有机质矿化释放了作物生长所需的养分，提高了土壤中氮、磷和钾的含量。

从Alpha 多样性分析可知，灌水高温闷棚联合有机物处理措施显著提高了根际土壤细菌的丰富度指数和多样性指数，这与刘亮亮等的研究结果一致。PCOA 分析显示各处理措施根际土壤微生物区系结构与对照明显不同，说明各处理措施均能提高土壤中微生物的多样性和丰富度。高温闷棚联合石灰氮处理措施中，施用石灰氮后土壤微生物丰富度并没有大幅度减少，可能是因为施用石灰氮后虽灭杀了大量的土壤微生物，但同时也为土壤微生物提供了生态位和氮源，为土壤微生物群落的恢复创造了条件，这与刘高峰等的研究结果一致。对细菌门水平的相对丰度分析显示，灌水高温闷棚联合石灰氮处理措施提高了土壤中厚壁菌门的相对丰度，这与前人报道相似。厚壁菌门大多是厌氧菌，也是产生有机酸的主要菌门，其产生的有机酸等代谢有毒物质可以对病原菌起到抑制和灭杀作用。聂园军等的研究表明，放线菌门和厚壁菌门有利于促进连作西瓜的生长。灌水高温闷棚联合有机物处理措施能提高变形菌门和拟杆菌门的相对丰度，但会降低放线菌门和厚壁菌门等有益菌门的相对丰度。此外，还会使酸杆菌门的相对丰度降低，这与陈静等的研究结果相同。通过亢余分析可知，硝态氮作为影响细菌群落的主要因素之一，与灌水高温闷棚联合石灰氮处理措施以及放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门呈负相关，说明降低土壤中硝态氮含量能改善土壤中放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门的生长环境。

4 结 论

（1）灌水高温闷棚结合有机物或石灰氮处理措施对芹菜连作土壤有改善作用，其中，灌水高温闷棚联合施用15 000 kg·hm麦糠和灌水高温闷棚联合施用900 kg·hm石灰氮的处理措施在缓解土壤酸化、提升土壤养分和作物产量方面效果最显著。

（2）灌水高温闷棚联合石灰氮处理措施能优化土壤原有的代谢关系，使土壤微生物区系变成了以放线菌门和厚壁菌门等厌氧菌为主的群落结构。

（3）由此可见，灌水高温闷棚联合施用900 kg·hm石灰氮的处理措施不仅能有效缓解芹菜根际土壤的连作障碍问题，还能改善土壤微生物群落结构。