瓜类细菌性果斑病国外研究新进展

费诺亚，陈华民，杨玉文，关 巍，刘宝玉，赵廷昌

（1.沈阳农业大学 沈阳 110866； 2.中国农业科学院植物保护研究所 北京 100193；3.巴彦淖尔市现代农牧事业发展中心 内蒙古 巴彦淖尔 015000）

瓜类细菌性果斑病（Bacterial fruit blotch，BFB）是由西瓜噬酸菌（）引发的高危种传细菌性病害，自1965 年首次在美国报道以来，不断向其他地区和国家扩散与传播，近几年在法国的瓜德罗普岛、北马其顿共和国等又有新的发现与报道，此外，关于西瓜噬酸菌新寄主番茄和茄子的报道也非常值得关注。西瓜感染该病原菌后，通常子叶叶缘出现水渍状病斑并沿叶脉发展，斑点周围有黄色晕圈。因其发生重、危害广、防治难等特点，多年来科研工作者们对西瓜噬酸菌（.）开展了大量研究。笔者对近5 年国外西瓜噬酸菌（.）的主要研究与报道进行了梳理，有助于制定科学有效的瓜类细菌性果斑病防治策略，并且可在一定程度上探明今后的研究方向。

1 西瓜噬酸菌种内分化

西瓜噬酸菌于2008 年正式被确立为一个独立的种，为变形菌门β-变形菌纲噬酸菌属的一个种。其种内可分为3 个亚组，在致病性方面，I 组菌株大多数分离自葫芦科的非西瓜寄主，对葫芦科中的几种寄主具有中等致病性或强致病性；而Ⅱ组菌株大多数分离自西瓜，对西瓜致病性强，但对葫芦科非西瓜寄主致病力弱，且I 组和II 组西瓜噬酸菌无论是在田间自然发病还是人工接种时都有明显的西瓜和甜瓜寄主偏好，尤其是在果实组织中更明显；Ⅲ组为一组弱致病性的菌株，最初发现于印度。I 组和Ⅱ组均已有代表菌株基因组数据上传至NCBI，在最近的研究中，Yang 等重新组装了I组菌株M6 的基因组数据，发现了一个天然存在的质粒pACM6，而在Ⅱ型菌株目前未发现有类似的质粒存在。

2 西瓜噬酸菌的检测

种子传播是BFB 的重要传播途径，因此，种子检疫与病原菌检测技术在控制病害中起着重要作用。目前，应用较多的检测技术多基于PCR 或血清学方法。

2.1 PCR检测

PCR 是检测病原菌中最常用的检测方法之一，在西瓜噬酸菌中有报道的PCR 检测方法包括传统PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）以及交叉引物核酸恒温扩增（cross-priming amplification，CPA）等。与其他检测方法相比，普通PCR 检测是较快的检测方式，qRT-PCR 则是人工成本较低的方法，且假阳性概率非常低。近年来，新的引物与PCR 检测体系不断被开发，Slovareva 与Starikova基于编码PAS 结构域（Per-周期昼夜蛋白-Arnt-芳基烃受体核转运蛋白-Sim-专一蛋白结构域）S-box 蛋白的序列，开发了一种新的鉴定西瓜噬酸菌的qPCR 检测引物PAS F/R 与鉴定方法；Shneider 等基于富亮氨酸重复核糖核酸抑制酶基因（Leucine-rich repeat ribonuclease inhibitor）设计并应用了新的引物AC-1 F/R 对西瓜噬酸菌进行检测。PCR 检测还可用于区分西瓜噬酸菌的不同亚组，Zhao 等利用不同组的特异性检测引物，建立了双重PCR 体系用于检测样品中I 组和Ⅱ组西瓜噬酸菌的分布情况。

2.2 血清学检测

基于免疫反应的检测方法在西瓜噬酸菌上的应用也有报道，但传统免疫学方法在灵敏度与准确度方面有一定欠缺，在现代成像技术的加持下，免疫学检测技术的灵敏度与准确性被不断推上新的峰值。侧向流动免疫分析（lateral flow immunoassays，LFA）快速检测试剂盒可以提供半定量结果，提高可重复性，并减少误差。Saisin 等通过手动优化图像采集设备的参数，如相机曝光时间等，与自动模式设置相比，将西瓜噬酸菌LFA 的检测限和灵敏度分别提高了3 倍和5 倍。

2.3 拉曼高光谱成像检测

除上述常见的检测方法外，研究人员也对其他一些检测方法进行了尝试，Hoonsoo 等认为拉曼高光谱成像技术在检测西瓜噬酸菌种子带菌方面具有较大的潜力，利用400～1800 cm范围内的拉曼高光谱成像数据，分析确定1 076.8 cm和437 cm处的2 条谱带可作为区分病菌感染种子和健康种子的最佳拉曼峰，具有快速、准确和非破坏性的优点。

3 西瓜噬酸菌的致病机制

虽然瓜类细菌性果斑病目前危害严重，但对致病菌致病机制的研究尚未形成完善的网络。深入了解西瓜噬酸菌致病过程，解析其致病机制，是研发靶向制剂及制定针对性防治策略的重要基础，也是防治果斑病的必由之路。近年来，国外对西瓜噬酸菌致病机制的研究主要集中在三型分泌系统、菌毛等关键致病因子方面。

目前，已经证明西瓜噬酸菌的三型分泌系统（Type Ⅲsecretion system，T3SS）是其关键致病因子，但其天然寄主西瓜由于遗传操作困难，在寄主与T3SS 的互作研究中，很难应用西瓜作为互作对象，严重限制了西瓜噬酸菌T3SS 的进一步研究。但随着烟草（species）被证明可作为西瓜噬酸菌的寄主并用于研究西瓜噬酸菌T3SS 在寄主中的作用机制，T3SS 效应蛋白（T3SS effectors，T3Es）及其作用靶标逐渐被发掘。基于AraC 型转录调节因子HrpX 对T3Es 编码基因的调控以及生物信息分析，Jiménez-Guerrero 等初步筛选到了7 个候选T3Es。2018 年，Rosenberg 等发现功能型Ⅳ菌毛（Type Ⅳpilus，T4P）是西瓜噬酸菌致病的重要因素之一，通过T4P 转座子突变体文库鉴定了多个突变体的表型，并对T4P 相关基因功能进行了研究，所有突变体均在定殖能力、致病能力及生物膜形成能力等方面弱于野生型M6。Kim 等证实了.中一个假定的双功能分支酸变位酶/预苯酸脱水酶CmpAc 和假定的Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase（GlpdAc）均与西瓜噬酸菌的毒力相关，且证明了GlpdAc 参与甘油代谢等。

4 瓜类细菌性果斑病的防治方法

现阶段，瓜类细菌性果斑病尚无商品化的、有推广价值的抗病品种，当前的很多抗性育种材料仍处于试验阶段或小范围应用中，主要的防治方法仍是农业防治、化学防治与生物防治等。

4.1 农业防治

硅肥被广泛应用于农业防治，含硅矿渣肥的施用使甜瓜的果斑病的病情指数显著降低了14%，发生率降低了12%，改善了土壤肥力、植株生长和营养状况，果肉厚度增加了8%，可溶性固形物含量增加了7%。同时，试验中也发现甜瓜不同杂交种之间的硅积累没有差异。一些传统的农业防治手段经当代分子生物学技术的揭示，对其有效性与作用机制都有了新的解读。Zhao 等研究了温度对西瓜噬酸菌定殖的影响，结果发现，与持续在28 ℃下培养相比，在28 ℃下播种并在接种后3 d 后转移到40 ℃下的种子果斑病发病率与带菌数量均显著降低；但温度升高对BFB 幼苗传播率降低的影响是可逆的，将种子从40 ℃再次转至28 ℃培养，果斑病发病率重新升高；且在接种后的前3 d，西瓜噬酸菌对温度最敏感。

4.2 化学防治

化学防治和种子处理仍是果斑病比较有效的防治方法，研究表明，利用ClO等进行种子处理可在对种子较安全的情况下有效减少种子的带菌量，但一些药剂如铜离子制剂处理可造成西瓜噬酸菌进入存活而不可培养状态（VBNC），若后续条件适宜，仍有复苏的可能。乙酸和丙酸蒸气（100 mg·L；50 ℃；相对湿度43%或85%）处理1 h 即对西瓜噬酸菌有显著的抑菌活性，且不会显著影响种子的发芽率。

4.3 生物防治

针对瓜类细菌性果斑病的生物防治也有诸多研究，目前已有多种生防菌株及其代谢产物被证明对西瓜噬酸菌有抑制效果，荧光假单胞菌（）、枯草芽孢杆菌（）、溶磷细菌伯克氏菌（sp.）、栖稻假单胞菌（）等及异常毕赤酵母菌（）都可一定程度降低病害发生率，噬菌体也被认为是潜在的生防材料。Rahimi-Midani 等利用从西瓜、甜瓜和南瓜中采集的样品分离的噬菌体建立了一种潜在的BFB 生物防治方法。其研究结果表明，未经噬菌体处理的种子接种西瓜噬酸菌后表现为不萌发或萌发后出现BFB 症状，相比之下，噬菌体包衣的西瓜种子在接种西瓜噬酸菌后可健康发芽的比例高达90%。另外，一些生防菌株的代谢产物如哈茨木霉产生的赖氨酸-α-氧化酶、新赤壳属的菌株（sp.）产生的萘醌类物质也对西瓜噬酸菌有抑制作用，基于比较基因组学等方法，其生防机制也逐渐清晰。但并非所有的生防菌都适用于西瓜噬酸菌，捕食性细菌蛭弧菌及其类似物（and like organisms，BALOs）会大量捕食其他细菌且杀菌谱较广。近期研究发现，西瓜噬酸菌对蛭弧菌具有一定抗性，Aharon 等通过对西瓜噬酸菌菌株M6 的文库建立与筛选，发现了西瓜噬酸菌编码微小假菌毛蛋白的基因在其对噬菌蛭弧菌（）的抗性方面起重要作用，且与II 型分泌系统相关。

4.4 抗病育种

目前市场上仍未发现具有较高商业价值的瓜类细菌性果斑病抗病品种，因此抗性材料的挖掘是目前瓜类细菌性果斑病抗病育种的首要任务。虽然尚无有价值的抗性材料投入到实际生产中，完全免疫瓜类细菌性果斑病的种质资源还未发现，但最近报道的瓜类对西瓜噬酸菌抗性相关QTL 为今后抗性品种的发掘与培育指明了方向。Islam 等通过生物测定和表达分析，鉴定了甜瓜基因组中6 个可能的抗BFB 候选R 基因。经进一步功能验证后，这些基因可以通过育种和生物技术手段靶向操纵以提高甜瓜BFB 抗性。从491 个分离的F甜瓜个体中确定了BFB 抗性的遗传模式，这些个体由BFB抗病（PI 353814）和感病（PI 614596）亲本杂交，F代均产生抗性，F代抗病和感病表型分离比例为3∶1。结果表明，BFB 抗性由1 个单基因显性基因控制。在对57 个瓜类抗病相关基因的调查中发现，只有在抗病和感病亲本之间显示多态性的基因（编码TIR-NBS-LRR 结构域）被认为是进一步研究的良好候选基因，该基因上显示出多个InDels和SNPs，基于感病材料的一个插入InDel 标记设计的MB157-2，能够在491 个F代和22 个地方品种/自交系材料中区分抗病和感病材料，检测准确率分别为98.17%和100%。这一基于PCR 的新型共显性InDel 标记为分子辅助育种提供了一种实用工具，旨在开发抗BFB 的甜瓜品种。Assunção 等鉴定了在不同物候期对细菌性果斑病具有遗传抗性的甜瓜材料，其中材料I-136 和A-43 表现出高水平的抗性，其果实没有出现果斑病症状，.的种子传播率仅为0.6%（I-136）和2.5%（A-43），可以作为果斑病抗性基因的亲本供体。

4.5 综合防治

Azman 等综述了近年来瓜类细菌性果斑病在诊断与防治方面的研究结果，可更好地了解这种病害，提出了种子处理-清除病原-抗性品种-种子健康测定-化学防治（Seed treatment-Pathogen exclusion-Resistant cultivar-Seed health testing-Chemical control）五位一体的防控模式，为制定最有效和可持续的BFB 控制策略提供指导。Shirakawa 团队报道了该病害在日本的首次发生，并对其防控相关技术进行了研究和开发，基于已有的研究结合日本及中国瓜类的实际种植情况提出了从引种到田间栽培期间的一系列果斑病的防控措施。

5 展 望

近年来，瓜类细菌性果斑病在病原菌检测、致病机制以及防治等方面的研究取得了很大进展。目前，国外多名学者在进行针对关键致病因子Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲsecretion system，T3SS）的研究。相当长一段时间内，T3SS 的机制研究都受限于寄主西瓜遗传操作体系的不成熟，但随着美国弗吉尼亚理工大学Traore 等证明模式植物烟草可作为西瓜噬酸菌的寄主并用于研究西瓜噬酸菌T3SS 在寄主中的作用机制，Ⅲ型效应蛋白的鉴定工作方面的瓶颈正逐渐被突破，越来越多的Ⅲ型效应蛋白陆续被报道，使得后续Ⅲ型效应蛋白在寄主中的靶标及相关互作研究成为可能。这也是今后西瓜噬酸菌致病机制研究的重要内容。以色列希伯来大学的Burdman 教授团队，基于调节因子HrpX 对西瓜噬酸菌I组菌株M6 中的T3Es 进行了大量的分析与预测，并在后续研究中对预测到的T3Es 进行了鉴定等工作。美国佐治亚大学的Walcott 教授团队在西瓜噬酸菌的不同组的分型与鉴定方面有较多成果，包括不同组的寄主偏好、遗传特性和分组方法等，为国内外的其他研究者提供了大量参考。其他一些国家例如日本和韩国的学者对各类型致病因子的研究也使得西瓜噬酸菌的致病相关调控网络更加明晰，其他一些致病相关基因也丰富了人们对其致病机制的理解。国内与国外各研究团队对果斑病与西瓜噬酸菌的研究各有侧重，但同时也有可以互相借鉴之处，综合各团队对果斑病的研究进展，可以对果斑病有更全面的了解。虽然对西瓜噬酸菌与瓜类细菌性果斑病的研究相对于其他植物病原细菌仍比较滞后，但在现有的研究基础上通过不懈的努力，将能够解开更多关于西瓜噬酸菌的谜题，并对瓜类细菌性果斑病有更全面的认知。

由于西瓜噬酸菌以种子携带形式，通过种子运输等方式进行短距离与长距离传播，因此，对种子的检疫工作非常艰巨且十分重要，已开发的多种检测技术能为种子检测提供技术支持。在病害防治方面，瓜类细菌性果斑病应用较多的仍是化学防治，使用药剂对种子进行处理是目前应用较广且行之有效的防治方法之一，针对该病害发生的现状，筛选出更多安全有效的药剂，将对今后药剂的轮换使用有指导意义。植物抗病性的利用和生物防治手段的开发是更安全的防治果斑病的手段，成为了近年来研究的热点，目前，虽然已经挖掘了部分针对西瓜噬酸菌的抗性材料与生防菌株，具有一定的应用前景，但从试验到应用仍有很长的路要走。为实现瓜类细菌性果斑病在生产上的高效防治，对果斑病菌致病机制的揭示、商品化抗性品种的筛选以及生物防治的机制等研究仍需继续探索。