甜瓜靶斑病病原菌的生物学特性

李俊香 洪霓 古勤生

摘    要：甜瓜（Cucumis melo L.）是我国重要的瓜类经济作物，多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的甜瓜靶斑病是近年新突发病害，通常引起叶部靶斑症状，对甜瓜生产造成重要损失。为了更好地防控甜瓜靶斑病，系统研究了多主棒孢甜瓜分离物广西菌株的生物学特性，深入探讨了该菌的最适产孢，菌丝生长及孢子萌发条件。结果表明，病原菌菌丝生长的最适碳源是葡萄糖，最适氮源是 KNO3，最适温度是27 ℃，最適pH是6～9，最适产孢培养基是寄主干叶培养基。分生孢子萌发的最适碳源是蔗糖和葡萄糖，最适pH是5～8。

关键词：甜瓜;多主棒孢;生物学特性

Abstract： Muskmelon （Cucumis melo L.） is one of the most economically important cucurbit crops grown commercially in China. The disease exhibited symptoms suggestive of target spot， is a newly emerging threat to muskmelon production in China， caused by Corynespora cassiicola. Therefore， the objective of the present study was to determine the biological characteristics of the pathogen， which include the optimal medium for sporulation and the conditions for mycelial growth and spore germination. The results disclosed that glucose and KNO3 were the best carbon and nitrogen sources for mycelial growth; the optimal temperature was 27 ℃， with an optimal pH range of 6-9; the dried leaf medium was the best among the tested media for sporulation. Optimal carbon sources for conidial germination were sucrose and glucose， with an optimal pH range of 5-8.

Key words： Muskmelon; Corynespora cassiicola;Biological characteristics

多主棒孢[Corynespora cassiicola （Berk. & M. A. Curtis） C. T. Wei]，属于重要植物病原菌[1]，寄主范围广泛[2]，可侵染烟草、番茄、棉花、黄瓜、芝麻、橡胶、大豆等[3-11]多种作物。该病原菌主要危害植物叶部形成靶状病斑[3-4]，也可侵染植物的花、茎、根和果实[12-13]。黄瓜、西瓜和甜瓜在我国具有重要的经济价值，栽培广泛。多主棒孢引起的黄瓜靶斑病首次在欧洲报道[14-15]，已有100多年的历史。黄瓜靶斑病在我国曾是次要病害，然而，近几年，该病已上升为主要病害，成为制约黄瓜产业发展的重要因素[16-17]。多主棒孢很少侵染甜瓜，直到最近几年，在海南三亚地区严重发生，发病株率达到30%～50%[18]。本实验室于2015年10月在我国广西武鸣甜瓜主要种植区进行病害调查时发现甜瓜靶斑病。

植物病原真菌培养条件的研究是病原学的重要组成部分，培养性状中共性的特征标志可以用于比较真菌的宏观差异以及辅助真菌分类而作为一项真菌分类标准[19]。多主棒孢的培养性状特征具有丰富的多样性，不同寄生环境，不同寄主来源以及不同地理来源的菌株存在着显著的差异，这些差异主要表现在菌落的颜色及形状，是否分泌色素，菌丝的类型及生长速度等几个方面[16，20-22]。综合而全面的分析病原菌的培养条件为分析病害发生的成因，探究病害防治的规律以及规划防治有效策略提供坚实的理论基础。然而，目前关于甜瓜上分离纯化的多主棒孢的培养性状等生物学特征的研究报道很少。笔者系统研究了多主棒孢甜瓜分离物广西菌株的生物学特性，深入探讨了该菌的最适产孢，菌丝生长及孢子萌发条件，以期对病害的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2016年5—10月在中国农业科学院郑州果树研究所病菌培养实验室进行。

1.1.1 供试菌株 多主棒孢（C. cassiicola）甜瓜分离物广西菌株Cc-GX为本实验室分离鉴定并保存。

1.1.2 供试培养基 马铃薯琼脂培养基（PDA）：土豆去皮切薄片200 g，加水煮沸30 min，双层纱布过滤，加20 g葡萄糖，15 g琼脂，定容至1 L。

查氏培养基（Czapek）：0.5 g MgSO4·7H2O，0.3 g KH2PO4，2 g KNO3，15g蔗糖，15 g 琼脂，蒸馏水定容至1 L。

燕麦培养基（YM）：燕麦20 g，加水煮沸20 min，双层纱布过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

燕麦葡萄糖培养基（YMT）：燕麦20 g，加水煮沸20 min，双层纱布过滤，加20 g葡萄糖，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

绿豆培养基（LD）：绿豆30 g，加水煮沸至开花，双层纱布过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

绿豆葡萄糖培养基（LDT）：绿豆30 g，加水煮沸至开花，双层纱布过滤，加20 g葡萄糖，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

绿豆芽培养基（LDY）：绿豆芽200 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KCl 0.2 g，（NH4）2HPO4 1 g，加水煮沸30 min，双层纱布过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

黄豆芽培养基（HDY）：黄豆芽200 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KCl 0.2 g，（NH4）2HPO4 1 g，加水煮沸30 min，双层纱布过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

西瓜鲜叶培养基（FW）：新鲜西瓜叶（‘红和平）200 g，加水煮沸20 min，双层纱布过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

黄瓜鲜叶培养基（FC）：新鲜黄瓜叶（‘黑优301）200 g，加水煮沸20 min，双层纱布过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

甜瓜鲜叶培养基（FM）：新鲜甜瓜叶（‘好运8号‘好运11号‘好运52号）200 g，加水煮沸20 min，双层纱布过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

西瓜干叶培养基（DW）：西瓜干叶（‘红和平）100 g，加250 mL水，打汁机打碎，放置10 min，双层纱布过滤，再加水，多次过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。0.1 MPa压力下，121 ℃湿热灭菌20 min。

黄瓜干叶培养基（DC）：黄瓜干叶（‘黑优301）100 g，加250 mL水，打汁机打碎，放置10 min，双层纱布过滤，再加水，多次过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

甜瓜干叶培养基（DM8）：甜瓜干叶（‘好运8号）100 g，加250 mL水，打汁机打碎，放置10 min，双层纱布过滤，再加水，多次过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

甜瓜干叶培养基（DM11）：甜瓜干叶（‘好运11号）100 g，加250 mL水，打汁机打碎，放置10 min，双层纱布过滤，再加水，多次过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

甜瓜干叶培养基（DM52）：甜瓜干叶（‘好运52号）100 g，加250 mL水，打汁机打碎，放置10 min，双层纱布过滤，再加水，多次过滤，15 g琼脂，蒸馏水定容至1 L。

以上培养基均在0.1 MPa压力下，121 ℃湿热灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 温度对菌丝生长的影响 将斜面上保存的菌落，转接于PDA平板中，于27℃黑暗活化培养7d。然后，用灭菌的打孔器从菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼，再依次将菌饼放置到新的PDA平板中央，每个平板接种一块菌饼。设置6个温度梯度，即23、25、27、29、31和33 ℃，再将接种后的PDA平板置于不同温度梯度的恒温培养箱中黑暗培养7 d，每个处理3次重复。并分别于培养3、5、7 d后采用十字交叉法测量菌落直径。观察菌落生长状况，记录菌落颜色、形状等。

1.2.2 pH对菌丝生长的影响 制备不同pH值的PDA平板，用1 mol·L-1 HCl 和1 mol·L-1 NaOH由低至高依次将PDA培养基的pH值调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。将活化培养后打取的菌饼依次放置到新的不同pH值的PDA平板中央，27 ℃黑暗培养7 d，每个处理3次重复。分别于培养的3、5和7 d后采用十字交叉法测量菌落直径。观察菌落生长状况，记录菌落颜色、形状等。

1.2.3 碳源对菌丝生长的影响 以Czapek培养基为基础培养基，分别以蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇、木糖、果糖、乳糖和麦芽糖9种不同的碳源替换其中的蔗糖，使得培养基最终含碳量均为6%。0.1 MPa压力下，121 ℃湿热灭菌20 min，添加葡萄糖的培养基灭菌15 min。依次将活化培养后打取的菌饼放置到新的含不同碳源的培养基平板中央，不含碳源的基础培养基做对照，于27 ℃黑暗培養7 d，每个处理3次重复。分别于培养的3、5和7 d后采用十字交叉法测量菌落直径。观察菌落生长状况，记录菌落颜色、形状等。

1.2.4 氮源对菌丝生长的影响 以Czapek培养基为基础培养基，分别以NaNO3、甘氨酸、NH4Cl、苏氨酸、（NH4）2·SO4、NH4NO3、KNO3和蛋白胨8种不同的氮源替换其中的KNO3，使得培养基最终含氮量均为0.03%。0.1 MPa压力下，121 ℃湿热灭菌20 min。依次将活化培养后打取的菌饼放置到新的含不同碳源的培养基平板中央，不含氮源的基础培养基做对照，于27 ℃黑暗培养7 d，每个处理3次重复。分别于培养的3、5和7 d后采用十字交叉法测量菌落直径。观察菌落生长状况，记录菌落颜色、形状等。

1.2.5 病原菌分生孢子的萌发规律和方式 将活化培养后打取的菌饼转接到新的PDA培养基中，27 ℃黑暗培养20 d使其自然产孢。然后，分别在各平板菌落上加10 mL无菌水，再用灭菌的毛笔扫落孢子，3层擦镜纸过滤获得孢子悬浮液。然后在低倍显微镜（10×10）下观察，用无菌水调节孢子悬浮液的浓度至每个视野约100个孢子。将孢子悬浮液滴于灭菌的凹型载玻片上，27 ℃黑暗保湿培养，于1、2、3、4 和6 h观察记录分生孢子的萌发率，萌发规律以及萌发方式。芽管长度超过孢子直径一半时视为萌发。每个处理3次重复。

1.2.6 pH对孢子萌发的影响 用1 mol·L-1 HCl 和1 mol·L-1 NaOH由低至高依次将孢子悬浮液pH值调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在低倍显微镜（10×10）下观察，孢子悬浮液的浓度为每个视野约100个孢子。将孢子悬浮液滴于灭菌的凹型载玻片上，27 ℃黑暗保湿培养，于3、6和12 h后观察记录分生孢子的萌发率。每个处理3次重复。

1.2.7 碳源对孢子萌发的影响 孢子悬浮液12 000 r·min-1离心10 min，去上清。分别用含碳量为0.6%的蔗糖，葡萄糖，可溶性淀粉，甘油，甘露醇，木糖，果糖，乳糖，麦芽糖溶液重悬孢子，然后在低倍显微镜（10×10）下观察，孢子悬浮液的浓度为每个视野约100个孢子。将孢子悬浮液滴于灭菌的凹型载玻片上，27 ℃黑暗保湿培养，于3、6和12 h后观察记录分生孢子的萌发速率。每个处理3次重复。

1.2.8 培养基种类对产孢的影响 试验设定15种培养基：PDA、YM、YMT、LD、LDT、LDY、HDY、FW、FC、FM、DW、DC、DM8、DM11、DM52。依次将活化培养后打取的菌饼放置到含不同培养基的平板中央，27 ℃黑暗培养7 d，然后，分别在各平板菌落上加5 mL无菌水，再用灭菌的毛笔扫落孢子，然后3层擦镜纸过滤获得孢子悬浮液，血球计数板计数，统计产孢量。每个处理3个重复。

1.2.9 数据处理 菌落生长速率和孢子萌发速率的影响试验，采用SAS 9.2 软件以邓肯氏多重极差测验法进行方法分析。孢子萌发与培养时间的关系则采用SAS 9.2 软件以简单线性回归进行回归分析，并求回归方程。

2 结果与分析

2.1 温度对Cc-GX菌株生长的影响

Cc-GX菌株在23～33 ℃ 的温度范围内都能生长，适宜的生长温度范围是25～29 ℃，最佳生长温度是27 ℃。低温和高温对菌落生长的影响都很大，温度过低或过高均可抑制菌落生长。培养7 d后，从23～27 ℃菌落生长速度逐渐变快，当培养温度超过31 ℃，培养时间超过7 d时，培养基变干，甚至隆起，抑制菌丝向四周扩展，菌落生长速度骤降（表1）。

2.2 pH对Cc-GX菌株生长的影响

Cc-GX菌株在pH为4～11的PDA培养基上均能生长。菌落生长速度受酸性环境抑制很明显，受碱性环境抑制不明显。当pH值为4时，菌丝生长明显受抑制，菌落最小。在pH值为10和11的PDA培养基中，菌落生长速度也较快，受影响较小，但菌落略微稀薄，菌落形状略不规则。6～9的pH的范围适宜Cc-GX菌株的生长，菌落致密，生长速度较快。菌落颜色随pH增加而逐渐加重，由灰白，浅灰，灰变为墨绿，浅褐，深褐色（表2，图1）。

2.3 碳源对Cc-GX菌株生长的影响

Cc-GX菌株在供试的9种碳源上均可生长。如图2所示，菌落在以可溶性淀粉为碳源的培养基上生长最快，其次是葡萄糖，且在这两种碳源培养基上菌落都很致密，颜色偏深。而在以甘油为碳源的培养基上，菌落生长速度也很快，但是菌落非常稀疏。在以木糖、蔗糖、麦芽糖和果糖为碳源的培养基上，菌落较厚，生长速度较慢，菌落这4种碳源培养基上生长速度差异均不显著，菌落形态与以葡萄糖做碳源的培养基上相似。另外，以甘露醇和乳糖为碳源的培养基上，菌落稀疏，颜色偏浅，色素积累少（表3）。

2.4 氮源对Cc-GX菌株生长的影响

Cc-GX菌株在以NaNO3，甘氨酸，NH4Cl，苏氨酸，（NH4）2·SO4，NH4NO3，KNO3和蛋白胨8种不同氮源的培养基中均能生长，但是菌落形态和生长速度表现出明显的差异。在以KNO3为氮源的培养基上，菌丝生长速度最快，其次是蛋白胨和NaNO3。但菌落在以蛋白胨为氮源的培养基比以KNO3和NaNO3为氮源的培养基致密很多。当氮源为甘氨酸和苏氨酸时，菌落生长速度稍慢，但是菌落比以KNO3和NaNO3为氮源的培养基稍密。而在以NH4Cl，（NH4）2·SO4和NH4NO3铵盐为氮源的培养基中，菌落扩展面积非常有限，菌丝几乎不向四周生长（表4，图3）。

2.5 Cc-GX菌株分生孢子萌发规律和特点

Cc-GX菌株分生孢子萌发速率观察结果显示，孢子在保湿培养1 h时开始萌发，2 h后萌发孢子数过半，6 h后萌发率达91.3%。根据萌发率与孵育时间求得的线性回归方程是 y=-0.051 1+0.172 8x（R2=0.923 6;x：孵育時间;y：萌发率）。电子显微镜观察发现分生孢子可在任意位置萌发，可以从孢子的一端、两端、一侧、两侧长出芽管，但最先在一端萌发，再两端萌发，随后中间细胞萌发（图4～5）。

2.6 pH对孢子萌发的影响

试验结果表明，Cc-GX菌株分生孢子在pH为4～11的环境条件下均能萌发。分生孢子在中性环境中萌发率最大，酸性和碱性环境对孢子萌发有抑制作用，且碱性比酸性环境对孢子萌发的抑制作用更大。当pH值<7时，萌发率随pH值增加而增加，当pH值>7时，萌发率随pH值增加而减小（表5）。

2.7 碳源对孢子萌发的影响

分生孢子在以蔗糖为碳源的条件下萌发率最高，27 ℃黑暗培养3 h，萌发率可达95%。葡萄糖、木糖和麦芽糖也利于孢子萌发，27 ℃孵育6 h，萌发率均超过90%。而在甘露醇和果糖做碳源时，孵育12 h，孢子萌发率才在90%以上。分生孢子在乳糖和甘油溶液中萌发率较低，而在可溶性淀粉做碳源时萌发率最低（表6）。

2.8 培养基种类对产孢的影响

分离的甜瓜多主棒孢Cc-GX菌株产孢能力相对较差。在试验设定的PDA、YM、YMT、LD、LDT、LDY、HDY、FW、FC、FM、DW、DC、DM8、DM11和DM52共15种培养基上，27 ℃黑暗培养7 d，产孢量均很少。相对来说，在以寄主植物叶片制作的培养基上产孢最多，但一个培养皿（直径9 cm）中培养7 d的菌落也只能产生约100 μL 106·mL-1的孢子。另外，研究发现，用寄主干叶制作的培养基比鲜叶更利于产孢。并且，黄豆芽培养基与寄主植物新鲜叶片制作的培养基对产孢的影响作用相差不大。但是绿豆、绿豆芽以及燕麦培养基非常不利于该菌株分生孢子的产生（表7）。

3 讨论与结论

2015年10月在我国广西武鸣甜瓜主要种植区进行病害调查时发现一种新的叶斑病。受害叶片经分离鉴定确定其病原菌为多主棒孢。多主棒孢的培养性状特征具有丰富的多样性，不同寄生环境，不同寄主来源以及不同地理来源的菌株存在着显著的差异。然而，目前关于甜瓜上分离纯化的多主棒孢的培养性状等生物学特征的研究报道很少。

笔者系统研究了甜瓜多主棒孢广西分离株Cc-GX的生物学特性，深入探讨了该菌的最适产孢，菌丝生长及孢子萌发条件。结果表明，该菌株可在温度为23～33 ℃以及pH值在4～11的范围内生长。而该菌株菌丝生长的最适碳源是葡萄糖，这与甜瓜分离物三亚菌株最适碳源为乳糖不同，该菌株最适氮源是KNO3，其次是NaNO3，又与甜瓜分离物三亚菌株最适氮源为NaNO3接近，另外，这两个甜瓜分离株的菌丝最适生长温度相似[18]。Cc-GX菌株菌丝生长受酸性环境抑制很明显，受碱性环境抑制不明显。该菌株在pH为4～11的PDA培养基上均能生长，最适pH是6～9，当pH值为4时，菌丝生长明显受抑制，这与甜瓜分离物三亚分离株也有明显差异[18]。但另有一个报道与本文研究结果相似，该报道研究的是多主棒孢黄瓜分离菌株，其菌丝生长温度范围是10～35 ℃，最适生长温度是30 ℃，可在3～12的pH值下生长，最适pH是5。但该黄瓜分离菌株菌丝生长最适碳源为乳糖，这与甜瓜分离物广西菌株不同，而与甜瓜分离物三亚菌株一致;另外，该黄瓜分离菌株的最适氮源为NH4NO3，这与甜瓜上的两个分离菌株最适氮源均不同，又与本研究Cc-GX菌株在以包含NH4NO3在内的3种铵盐为氮源的培养基中，菌丝生长严重受抑制，结果完全相反[23]。

Cc-GX菌株分生孢子通常为极端细胞萌发，中间细胞也可以萌发，但相对较少，这与多主棒孢黄瓜分离菌株类似[23]。另外，Cc-GX菌株分生孢子在pH为 4～11条件下均能萌发，最适pH为5～8，最适碳源为蔗糖和葡萄糖，然而，该黄瓜分离菌株分生孢子可在3～13的 pH环境下萌发，最适pH值为5～6，且不同碳源对孢子萌发没有明显差异。

这些培养性状的差异，可能源于菌株来自不同寄生环境，不同寄主来源以及不同地理位置。植物病原真菌培养条件的研究是病原学的重要组成部分，综合而全面的分析病原菌的培养条件可为分析病害发生的成因，探究病害防治规律以及规划防治有效策略提供坚实的理论基础。

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