超声波辅助酶法提取‘蜜本南瓜’水不溶性膳食纤维工艺优化及理化性质测定

摘    要： 通过初选酸法、碱法和超声波辅助酶法提取‘蜜本南瓜水不溶性膳食纤维（Insoluble dietary fiber，IDF），选用酶法进行提取试验。结果显示，料液比、超声时间、木瓜蛋白酶酶解温度对南瓜IDF得率的影响较其他单因素显著。进一步响应面试验优化得出IDF的最佳提取工艺参数是：液料比14.5 mL·g-1、超声时间15 min和木瓜蛋白酶酶解温度60.67 ℃，在此条件下南瓜IDF的得率可达29.99±0.1%。经理化测定，‘蜜本南瓜IDF的持水力为（7.10±0.05） g·g-1，持油力为（1.03±0.09） g·g-1，膨胀力为（5.52±0.08） mL·g-1。IDF中游离酚含量为（187.97±0.20） mg GAE·100 g-1，结合酚含量（82.62±0.14） mg GAE·100 g-1。此外，IDF对·OH、DPPH·和O2-·均有一定的清除能力，与其所含酚类的成分有关。综上，超声波辅助酶法提取南瓜IDF方法切实可行，产品具有良好的理化特性，是一种天然的抗氧化膳食纤维，发展前景广阔。

关键词： 南瓜; IDF; 超声波辅助酶法; 工艺优化; 理化性质

Abstract： By comparing the method of acid， alkaline， and ultrasonic assisted enzymatic extraction of Insoluble dietary fiber （IDF） from Cucurbita moschata Duch.， the enzymatic method was chosen in this test. The results showed that the ratio of solid to liquid， ultrasonic time， enzymatic temperature of papain were more significant than other single factors on the yield of IDF. Through further response surface optimization experiments， the optimal extraction parameters of pumpkin IDF were as follows： liquid-to-liquid ratio 14.5 mL·g-1， ultrasonic time 15 min and papain digestion temperature 60.67 ℃. Under this condition， the extract yield of IDF can be high of （29.99±0.1）%. By the determination of managerial properties， the water holding capacity of IDF was （7.10±0.05） g·g-1， the oil holding power was （1.03±0.09） g·g-1， the expansion force was （5.52±0.08） mL g-1. The content of free phenol in pumpkin IDF was （187.97±0.20） mg GAE·100 g-1 and the bound phenol content was （82.62±0.14） mg GAE·100 g-1. Besides， Pumpkin IDF had the ability to scavenge ·OH， DPPH· and O2-·， which may be due to the phenolic compounds. In summary， the ultrasound-assisted enzymatic extraction method of pumpkin IDF was feasible， and the product not only had good physicochemical properties， but also can be characterized as natural antioxidant dietary fiber， which was of broad prospects for development.

Key words： Cucurbita moschata Duch.; Insoluble dietary fiber; Ultrasonic assisted enzymatic method; Process optimization; Physicochemical property

南瓜是葫芦科南瓜属植物，适应性强，易栽植，我国南瓜产量占世界总产量的3/10（约1.8×107 t），居全球第二，资源非常丰富[1]。‘蜜本南瓜（Cucurbita moschata Duch.）是我国常见的南瓜品种，其糖度和粉度均高于普通品种，营养丰富，且具有诸多生物学功效[2]。尤其是南瓜中丰富的膳食纤维能够有效调节膳食营养平衡，保障身体健康，比如减肥、降血糖、降血脂[3]、提高免疫能力以及预防结肠癌等胃肠道疾病等[4]。据报道，植物性膳食纖维已被证实具有显著的抗氧化活性[5]，并且已广泛应用于食品保鲜与功能食品研发等领域[6]。目前，针对于膳食纤维提取的报道既有传统的酸法、碱法，又有绿色化学法[7]、发酵法[8]、联合酶解法[9]、辅助酶解法[10]等，但是近3年国内对于南瓜中膳食纤维提取的研究较少。因此，笔者以中国常见品种‘蜜本南瓜为研究对象，不仅比较了常用酸法、碱法、酶法对IDF得率的影响，还进一步优化了液料比、糖化酶酶溶液用量、糖化酶酶解温度、糖化酶酶解时间、超声时间、木瓜蛋白酶酶解温度及酶解时间7个单因素，以期获得简单易行的提取工艺参数。同时，通过对提得‘蜜本南瓜的IDF进行理化指标分析，以期为其研发利用提供理论依据和创新基础。

1 材料与方法

1.1 材料

‘蜜本南瓜由大闽生物科技（漳州）有限公司选育，糖化酶、木瓜蛋白酶：20 000 U·g-1，由河南亚统食品原料有限公司提供;没食子酸、硫酸亚铁·七水合物、福林酚、邻苯三酚为AR级，由麦克林公司提供;抗坏血酸、2，2-联苯基-1-苦基肼基为AR级，由国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 方法

试验于2018年9—10月在闽南师范大学生物科学与技术学院实验室进行。将同一批次的‘蜜本南瓜进行清洗、切片后，于60 ℃鼓风烘干，粉碎过60目筛，制得南瓜粉末，放入密闭干燥的容器保存备用。

粗蛋白的测定参考GB 5009.5-2016 中的凯氏定氮法处理，使用自动凯氏定氮仪进行测定。氨基酸的测定参考GB 5009.124-2016处理，使用氨基酸分析仪进行测定。粗脂肪的测定参考GB5009.6-2016，使用索氏提取法进行测定。可溶性糖的测定参考Liobera 等[11]方法。

以IDF得率为指标，比较以下3种提取方法的得率高低，并选择一种较优的方法进行优化。

碱法：参考丁莎莎等[12]方法。按液料比20 mL·g-1加入40 mL质量分数2%的NaOH溶液，60 ℃水浴提取1 h，5 000 r·min-1离心15 min，洗涤并收集滤渣，干燥称重得IDF。

酸法：参考郭宝颜等[13]方法。调整pH=4，60 ℃恒温水浴1 h，5 000 r·min-1离心15 min，洗涤并收集滤渣，干燥后得IDF，称重计算得率。

超声波辅助酶法：参考李建周等[14]方法略微修改。按照料液比20 mL·g-1加入去离子水，126 W超声处理5 min，调节pH为4.0～4.4，加入50 mg·mL糖化酶溶液0.5 mL，混合均匀并用保鲜膜密封，60 ℃水浴酶解50 min，再调节pH至6.0～8.0，添加50 mg·mL的木瓜蛋白酶溶液0.5 mL，搅拌均匀后用保鲜膜密封，60 ℃水浴45 min，而后5 000 r·min-1离心15 min，滤渣洗涤后烘干称重，计算得率。

1.2.1 单因素试验 （1）液料比对南瓜IDF得率的影响

考察料液比10、15、20、25、30 mL·g-1对南瓜IDF得率的影响。其他反应条件为：超声时间15 min、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解温度60 ℃、糖化酶酶解时间50 min、木瓜蛋白酶酶解温度60 ℃、木瓜蛋白酶酶解时间45 min。

（2）超声时间对南瓜IDF得率的影响

考察超声时间取5、10、15、20、25 min时对南瓜IDF得率的影响。其他反应条件为：料液比15 mL·g-1、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解温度60 ℃、糖化酶酶解时间50 min、木瓜蛋白酶酶解温度60 ℃、木瓜蛋白酶酶解时间45 min。

（3）糖化酶溶液用量对南瓜IDF得率的影响

考察糖化酶溶液添加量为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL时对南瓜IDF得率的影响。其他反应条件为：料液比15 mL·g-1、超声时间15 min、糖化酶酶解温度60 ℃、糖化酶酶解时间50 min、木瓜蛋白酶酶解温度60 ℃、木瓜蛋白酶酶解时间45 min。

（4）糖化酶酶解温度对南瓜IDF得率的影响

考察糖化酶酶解温度取50、55、60、65、70 ℃时对南瓜IDF得率的影响。其他反应条件为：料液比15 mL·g-1、超声时间15 min、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解时间50 min、木瓜蛋白酶酶解温度60 ℃、木瓜蛋白酶酶解时间45 min。

（5）糖化酶酶解时间对南瓜IDF得率的影响

考察糖化酶酶解时间为10、30、50、70、90 min时对南瓜IDF得率的影响。其他反应条件为：料液比15 mL·g-1、超声时间15 min、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解温度 55 ℃、木瓜蛋白酶酶解温度60 ℃、木瓜蛋白酶酶解时间45 min。

（6）木瓜蛋白酶酶解溫度对南瓜IDF得率的影响

考察木瓜蛋白酶酶解温度在50、55、60、65、70 ℃时对南瓜IDF得率的影响。其他反应条件为：料液比15 mL·g-1、超声时间15 min、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解温度 55 ℃、糖化酶酶解时间30 min、木瓜蛋白酶酶解时间45 min。

（7）木瓜蛋白酶酶解时间对南瓜IDF得率的影响

考察木瓜蛋白酶酶解时间为15、30、45、60、75 min，对南瓜IDF得率的影响。其他反应条件为：料液比15 mL·g-1、超声时间15 min、糖化酶溶液用量0.5 mL、糖化酶酶解温度 55 ℃、糖化酶酶解时间30 min、木瓜蛋白酶酶解时间45 min。

1.2.2 响应面试验 在单因素试验的基础上，选定料液比（A）、超声时间（B）和木瓜蛋白酶酶解温度（C）3个对南瓜IDF得率影响比较显著的因素，设计3因素3水平的响应面试验表（表1），优选南瓜IDF提取的最佳工艺。

1.2.3 最优组合验证试验 按理论最优工艺条件进行验证试验。

1.2.4 南瓜IDF理化性质的测定 （1） 持水力

称取1.000 g提得IDF粉末（M0）于100 mL烧杯中，按料液比40 mL·g-1加入40 mL去离子水，混匀后静置1 h，3 500 r·min-1离心0.5 h，倾去上清液，滤渣甩干水分后称重（M1）[15]。

持水力（WHC）=[M1（g）-M0（g）]/M0（g），单位g·g-1。

（2）持油力

取1.000 g IDF粉末（ K0）于50 mL 的离心管中，按比例25 g/g加入大豆油25 g，37 ℃静置1 h，3 000 r·min-1离心20 min，倒掉表层油脂，剩下的油脂及样品用20目筛网过滤，用滤纸吸去多余油脂，称得质量K1[16]。

持油力=（K1-K0）/K0，单位：g·g-1。

（3）膨胀力

称取0.5 g IDF粉末（m）置于量筒中，按料液比30 mL·g-1加入15 mL去离子水，搅拌均匀，室温静置1天，读取量筒中IDF膨胀后的体积数（V），最后将膨胀后的体积除去粉末样品质量[17]。

膨胀力=V/m，单位：mL·g-1。

（4）游离态和结合态多酚的提取和测定

①游离酚提取：称取1.00 g IDF粉末于100 mL离心管中，按料液比50 mL·g-1加入80%的冷冻丙酮溶液50 mL-1，闪式浸取10 min，3 500 r·min-1下离心10 min，反复提取残渣，收集合并上清液，将上清液旋转浓缩，在45 ℃下浓缩至低于10 mL，再用甲醇定容于25 mL，并在-80 ℃下保藏直至测定[18]。

②结合酚提取：按料液比40 mL·g-1加入40 mL盐酸-甲醇1.2 mol·L-1溶液和2 mg抗坏血酸抗氧化剂与提取完游离酚的样品残渣在35 ℃下水浴振荡16 h，过滤取滤液在45 ℃下旋转浓缩至近干，再用甲醇定容至25 mL，而后在-80 ℃下保存直至分析[19]。

③酚含量的测定：移取0.2 mL的没食子酸标准溶液或适当稀释后的多酚样品提取液于10 mL比色管中，再加入超纯水0.8 mL，随后加入0.2 mL福林酚试剂，混合均匀，放置6 min后再加入7%的碳酸钠溶液1.0 mL，最后用蒸馏水定容至5 mL，室温下反应90 min后，波长760 nm处，测定吸光值Ai，酚含量用没食子酸当量（mg GAE·100 g-1）表示[20]。

多酚含量（mg GAE·100 g-1）=C×V/m。

V-提取液总体积（mL），M-样品质量m（g），C-每毫升提取液中南瓜不溶性膳食纤维中总多酚含量（mg·mL-1）

（5）清除羟基自由基（·OH）能力的测定

参考Cotelle等[21]方法，取3.0 mL的2.50 mmo1·L-1邻二氮菲溶液和2.0 mL pH=7.4的磷酸盐缓冲液并混匀，再加入1.0 mL的1.0 mL·L-1 H2O2和15.0 mmo1·L-1 FeSO4溶液0.5 mL，再用去离子水定容至10.0 mL，37 ℃恒温水浴1 h，在510 nm 处测定吸光度λ1;之后分别加浓度不同的试样溶液1 mL，再加l.0 mL·L-1的H2O2 1.0 mL-1，未损害管不需要加l.0 mL·L-1 H2O2和提取物，分别得到吸光度λ2、λ0。

·OH清除率的计算如下：清除率/%=（λ2-λ1）/（λ0-λ1）×100。

式中：λ0-未损害管，λ1-损害管，λ2-加提取物。

（6）清除超氧阴离子自由基（O2-·）能力的测定

参考张志旭等[22]方法，取10 mL-1的比色管加入4.5 mL Tris-HCI缓冲溶液并在20 ℃中水浴20 min，再分别加1 mL不同浓度的试样溶液和25 mmo1·L-1邻苯三酚溶液0.4 mL，混合均匀，水浴25 ℃反应5 min，再加入8 mo1·L-1的盐酸1 mL，299 nm处测定吸光度A1，空白对照用超纯水水代替样品液，测定吸光度A0。

O2-·清除率的计算如下：O2-·清除率/%=（A0-A1）×100/A0。

（7）清除DPPH·能力的测定

参考李继仁等[23]方法，分别各取2 mL浓度不同样品液于10 mL比色管中，加入2.0 mL 2×10-4 mol·L-1 DPPH溶液，混匀反应0.50 h，517 nm处测定吸光值，还有测定超纯水替代样品液的空白样品、样品空白的吸光值。

DPPH·抑制率的计算如下：抑制率/%=[A0-（A1-A2）]×100/A0

式中：A0—乙醇2.0 mL+ DPPH溶液2.0 mL的吸光值;

A1—DPPH溶液2.0 mL+ 樣品液2.0 mL的吸光值;

A2—样品液2.0 mL+乙醇2.0 mL的吸光值。

1.3 数据处理

用SPSS 16.0和Design Expert 7.1进行数据分析。方差分析用Turkeys HSD 进行分析，数据以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 原料化学组成分析

‘蜜本南瓜中的粗蛋白、粗脂肪及可溶性糖的含量如表2所示，氨基酸组成见表3，氨基酸评分（AAS）和氨基酸比值（RAA）见表4。

2.2 不同方法对IDF得率的影响

酸法、碱法、酶法都是常用的IDF提取方法，化学法提取最为快速简便[24]，水提法得率较低，但操作简易，环境污染小;酶法提取条件温和，杂质残留少，适合淀粉、蛋白质含量高的原料;酶法辅助提取兼具两种提取方式的长处，不仅得率高，酸碱使用量较少，降低对IDF中活性物质影响，可得纯度和活性较高的IDF[25]。从图1可知，超声波辅助酶法的提取效果较佳，碱法次之，酸法的得率较差。故笔者将进一步优化超声波辅助酶法工艺。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 液料比对南瓜IDF得率的影响 从图2能够看出，当液料比为15 mL·g-1时南瓜IDF得率达到最大值27.82%，之后随着料液比的增加南瓜IDF的得率显著降低。

3 结 论

采用超声波辅助酶法提取南瓜IDF的最佳工艺为：料液比14.5 g·mL-1、超声时间15 min、糖化酶酶溶液用量500 μL·g-1，糖化酶酶解温度55 ℃，木瓜蛋白酶酶解时间30 min，木瓜蛋白酶酶解温度60.67 ℃，此时，南瓜IDF的得率最大为（29.99±0.1）%，与理论预测值相近，方法可行。此外，通过理化性质测定，所提南瓜IDF持水力为（7.10±0.05） g·g-1，持油力为（1.03±0.09） g·g-1，膨胀力為（5.52±0.08） mL·g-1;其结合酚含量为（82.62±0.14） mg GAE·100 g-1，游离酚含量为（187.97±0.20） mg GAE·100 g-1;IDF具有显著的·OH、O2-·、DPPH·的清除能力，是一种具有生物活性的天然抗氧化膳食纤维，具有广阔的市场前景。

参考文献

[1] 张箭.南瓜发展传播史初探[J].烟台大学学报（哲学社会科学版），2010，23（1）：100-108.

[2] 王士苗，康文艺，孙丽，等.25个南瓜品种不同溶剂提取物抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2015，36（7）：118-121.

[3] 罗双群，张桂红，陈海伟，等.南瓜功能特性研究进展[J].粮食与油脂，2012，25（4）：47-49.

[4] KACZMARCZYK M M，MILLER M J，FREUND G G，et al.The health benefits of dietary fiber：beyond the usual sus-pects of type 2 diabetes mellitus，cardiovascular disease and colon cancer[J].Metabolism，2012，61（8）：1058-1066.

[5] 谌小立，赵国华.抗氧化膳食纤维研究进展[J].食品科学，2009，30（5）：291-294.

[6] 王思远，刘学铭，陈智毅，等.富含膳食纤维的柚皮粉制备及其特性研究[J].现代食品科技，2014，30（11）：170-174.

[7] ROUHOU M C ，ABDELMOUMEN S，THOMAS S，et al.Use of green chemistry methods in the extraction of dietary fibers from cactus rackets （Opuntia ficus indica）：Structural and microstructural studies[J].International Journal of Biological Macromolecules，2018，116（9）：901-910.

[8] 闵钟熳，高路，高育哲，等.黑曲霉发酵法制备米糠粕可溶性膳食纤维工艺优化及其理化分析[J].食品科学，2018，39（2）：112-118.

[9] BEN?TEZ V，ESTEBAN R M，MONIZ E，et al.Breads fortified with wholegrain cereals and seeds as source of antioxidant dietary fibre and other bioactive compounds[J].Journal of Cereal Science，2018，82（7）：113-120.

[10] 薛山.紫薯不溶性膳食纤维超声辅助酶法提取工艺及抗氧化活性研究[J].食品与机械，2018，34（5）：153-157.

[11] LIOBERA A，CANNELLAS J.Dietary fibre content and antioxidant activity of manto negro red grape （Vitis vinifera）：pomace and stem[J].Food Chemistry，2007，101（2）：659-666.

[12] 丁莎莎，黄立新，张彩虹，等.油橄榄果渣膳食纤维碱法提取工艺优化及其理化性质研究[J].林产化学与工业，2017，37（1）：116-122.

[13] 郭宝颜，邓青，周爱梅，等.茭白不溶性膳食纤维的提取工艺优化及性能对比[J].食品工业科技，2014，35（23）：257-260.

[14] 李建周，陈晓华，罗思诗，等.豆渣中水不溶性膳食纤维的提取及性质研究[J].食品研究与开发，2017，38（7）：29-33.

[15] 曾庆梅，杨毅，殷允旭，等.梨渣水不溶性膳食纤维的提取工艺研究[J].食品科学，2008，29（8）：275-278.

[16] 高荫榆，晁红娟，丁红秀，等.毛竹叶特种膳食纤维制备及特性的研究[J].食品科学，2007，28（12）：200-204.

[17] 宋慧，苗敬芝，董玉玮，等.超声结合酶法提取花生粕中水溶性膳食纤维及其功能性研究[J].食品研究与开发，2014，35（5）：44-48.

[18] OKATER N，LIU C，SORRELLS M.E，et al.Phytochemical content and antioxidant activity of six diverse varieties of whole wheat[J].Food Chemistry，2010，119（1）：249-257.

[19] NUUTILA A.M，KAMMIOVIRTA K，OKSMAN-CALDENTEY K，et al.Comparison of methods for the hydrolysis of flavonoids and phenolicacids from onion and spinach for HPLC analysis[J].Food Chemistry，2002，76（4）：519-525.

[20] CHU Y，SUN J，WU X，et al.Antioxidant and anti-proliferative activities of common vegetables[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（23）：6910-6916.

[21] Cotelle N.Antioxidant properties of hydroxyl flavones[J].Free Radical Biology and Medicine，1998，20（1）：35-43.

[22] 张志旭，陈岳文，刘东波，等.苦瓜膳食纤维的抗氧化活性研究[J].现代食品科技，2012，28（8）：933-935.

[23] 李继仁，赵玉英.三种松果菊化学成分与生物活性研究进展[J].中国中药杂志，2002，27（5）：334-337.

[24] KACZMARCZYK M M，MILLER M J，FREUND G G，et al.The health benefits of dietary fiber：beyond the usual suspects of type 2 diabetes mellitus，cardiovascular disease and colon cancer[J].Metabolism，2012，61（8）：1058-1066.

[25] 赵梅，慕鸿雁.从麦麸中提取水不溶性膳食纤维的研究[J].食品工业，2013，34（1）：77-80.

[26] 赖爱萍，陆国权，王颖，等.超声波辅助酶法制备甘薯渣膳食纤维工艺研究[J].中国粮油学报，2015，30（8）：100-102.

[27] 刘嘉，董楠，赵国华，等.微波辅助快速制备马铃薯羧甲基淀粉条件的优化[J].中国粮油学报，2011，26（11）：36-41.

[28] 薛山，何小宝.葡萄皮渣中可溶性抗氧化膳食纤维 提取工艺及羟自由基清除作用[J].中國食品添加剂，2017（9）：160-170.

[29] 薛山.柑橘皮渣中非水溶性抗氧化膳食纤维提取工艺优化[J].食品与机械，2016，32（8）：151-155.

[30] S?NCHEZ-ALONSO I，JIM?NEZ-ESCRIG A，SAURA-CALITO F，et al.Antioxidant protection of white grape pomace on restructured fish products during frozen storage[J].LWT-Food Science and Technology，2008，41（1）：42-50.

[31] SANCHEZ-ALONSO I，BORDERIAS A J，LARSSON K，et al.Inhibition of hemoglobin-mediated oxidation of regular and lipid-fortified washed cod mince by a white grape dietary fiber[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（13）：5299-5305.

[32] S?NCHEZ-ALONSO I，BORDE?AS A J.Technological effect of grape antioxidant dietary fibre added to minced fish muscle[J].International Journal of Food Science and Technology，2008，43（6）：1 009-1 018.

[33] CHAU C，HUANG Y.Comparison of the chemical composition and physicochemical properties of different fibre prepared from de peel of Citrus sinensis L.cv.Liucheng[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（9）：2 615-2 618.

[34] P?REZ-JIM?NEZ J，SERRANO J，TABERNERO M，et a1.Effects of grape antioxidant dietary fiber in cardiovascular disease risk factors[J].Nutrition，2008，24（7/8）：646-653.