167份西瓜种质材料的遗传多样性分析

郭禄芹 赵世豪 朱华玉 胡建斌 孙守如 马长生 杨路明

摘要：以来自世界各地的167份西瓜种质资源为材料，利用形态学标记和SSR标记，结合多样性分析、聚类分析和主坐标分析等方法，对其遗传多样性进行了系统全面的研究。结果表明，29个表型性状Shannon多样性指数的变化范围是0.54～2.03，平均值为1.50，其中质量性状平均值为1.16，数量性状为1.71;18个数量性状的变异系数变化范围为16.43%～90.73%，平均值为34.12%。不同地区西瓜种质遗传多样性比较结果显示，非洲地区的种质遗传多样性丰富，亚洲、北美洲次之，南美洲和欧洲的遗传多样性相对较低。同时，利用22对SSR标记对西瓜种质进行了遗传多样性分析，平均每对引物扩增4.86个等位基因，平均有效等位基因数（Ne）是2.20，平均Shannon多样性指数（I）为0.94，平均观测杂合度（HO）为0.27，平均期望杂合度（He）为0.52，平均多态性信息含量（PIG ）为0.45。进一步分别利用表型标记和SSR标记对167份西瓜种质材料进行分类，结果显示SSR标记的稳定性强，能够很好的对种质材料进行分类。

关键词：西瓜;遗传多样性;形态学标记;SSR标记

西瓜（Citrullus lauatus）是一种重要的园艺作物，也是全世界最受欢迎的水果之一。它属于葫芦科（Cucurbitaceae）西瓜属（Citrullus），西瓜属包含4个种：西瓜种[Citrullus lauatus （Thunb.） Matsum.&Nakai;）、药西瓜种[C. Colocyuthis（L.）Schrad]、缺须西瓜种[C. Ecirrhosus Cogn.]和诺典西瓜种[C. nau-clinianus （Sond.）Hook.f]。西瓜种包括毛西瓜亚种（ssp. lauatus）、普通西瓜亚种（ssp. vulgaris）、黏籽西瓜亚种（ssp. mucososperm，us）。为了对重要的农艺性状如品质和产量等进行遗传改良，育种家们对西瓜进行了长期的筛选和驯化，栽培西瓜的遗传背景较窄，且大多对病害和虫害没有抵抗力，严重限制了西瓜育种材料的改良与创新。遗传多样性是作物种质资源及遗传育种研究的基础，因此，对来自于世界不同国家和地区的西瓜种质材料进行遗传多样性分析、评价不同材料间的差异与亲缘关系，对于解决目前栽培西瓜育种材料过于单一的遗传瓶颈具有重要意义。

形态学标记和分子标记已广泛应用到西瓜种质的遗传多样性研究中，特别是分子标记技术如RAPD、AFLP、SSR和SNP等。其中，SSR标记由于具有共显性、多态性好和操作简便等优点，已经逐渐成为西瓜遗传多样性研究的首选标记。迄今国内外已有不少学者对不同西瓜材料进行了遗传多样性分析。2012年尚建立等以我国西瓜种质资源中期库1200份西瓜种质为材料，利用12个形态学性状对其进行遗传多样性和相关性分析，12个性状的多样性指数均值为1.70，数量性状变异系数平均值为31.8%，果实形状和果形指数、果肉颜色和中心糖含量、果肉颜色和种子千粒重、果皮厚度和硬度4对性状相关性极显著。2013年纪海波调查了768份西瓜种质资源的24个表型性状，变异系数均值为32.41%，多样性指数均值为1.6。2015年潘存祥等对国内外783份西瓜种质资源的24个表型性状进行了遗传多样性研究，结果表明，西瓜种质资源24个表型性状的平均变异系数为31.19%，平均遗传多样性指数为1.68，在欧氏距离为25时聚为2类，在欧氏距离为20时聚为3类。2015年戴照义等以88份来源不同的西瓜种质资源为材料，利用37个表型性状和22对SSR分子标记进行遗传多样性分析，研究结果表明，表型性状的变异主要体现在果实形状和品质等性状上。依据表型性状进行聚类分析，在欧氏距离15.0时，供试材料聚为2类，在欧氏距离13.5时，供试材料聚为3类;22对SSR分子标记共扩增出55个多态性位点，平均多态性信息含量为0.41，利用UPGMA法进行聚类分析，可将88份西瓜种质聚为4类。2016年，石磊利用39个表型性状和31对SSR标记对50份籽用西瓜种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，结果表明，39个表型性状的变异系数平均值为32.24%，其中39个表型性状的Shannon多样性指数平均值为5.47，聚类分析中，野生型和普通西瓜各聚为一类，籽瓜种质聚为一类。基于SSR标记的聚类分析中，种质之间相似系数变化范围为0.57～0.91，在相似系数为0.657处，50份籽用西瓜种质可分为6组。基于SSR标记的主坐标分析结果表明，50份籽用西瓜划分为4组。

笔者利用29个形态学性状和平均分布在11条染色体上的22对SSR标记对来源于世界各地的167份西瓜种质进行遗传多样性分析，旨在了解西瓜种质资源多样性的分布情况和各种质间的亲缘关系，为西瓜种质资源的遗传改良和种质创新奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为167份西瓜种质资源，其中161份由美国农业部（USDA-ARS）提供，另有6份由瓜类种质遗传改良与分子育種课题组收集的西瓜材料。这167份材料来源于世界各地，其中来源于美国48份，中国21份，南非13份，印度11份，加纳和尼日利亚各6份，津巴布韦、印度尼西亚和苏联各4份，苏丹、土耳其、日本等6个国家各3份，乌兹别克斯坦、索马里等7个国家各2份，埃及、智利、加拿大等18个国家各1份。

1.2 材料种植与表型调查

材料于2016年3月26日种植在郑州市毛庄绿园蔬菜生产基地日光温室中，采用随机区组方式种植，5次重复，每垄2行，行距1.6m，每行定植18株，株距0.5m，开花期进行人工授粉，常规管理。在西瓜生长不同时期，参照《西瓜种质资源描述规范和数据标准》对29个表型性状进行调查记录。

1.3 DNA提取与分子标记分析

在幼苗期采集幼嫩叶片，采用改良 CTAB法提取西瓜供试样品DNA。笔者从Zhu等西瓜全基因组开发的SSR引物中选取了22对引物进行基因型分析，PCR反应体系为10μL，其中DNA 25ng，SSR引物0.5μmol·L^-1，dNTP 0.2 mol·L^-1，和0.5UTaq酶，1×PCR buffer， PCR产物采用聚丙稀酰胺凝胶电泳，利用银染法显色，并拍照保存。

1.4 数据分析

11个西瓜质量性状按照表1进行赋值，并统计各性状的频率分布及其多样性指数。采用Excel2010统计各性状数据，并计算各数量性状的最大值、最小值、平均值、极差和变异系数。各性状的遗传多样性采用Shannons信息指数（1）进行评价，I=-∑（Pi）（lnPi）， Pi表示第i种变异类型出现的频率。采用SPSS 22软件对各性状进行方差分析。采用MEGA 6.0软件对167份西瓜种质进行聚类分析。使用NTSYS-pc 2.1软件对167份西瓜种质进行主坐标分析。

根据PCR扩增结果选择重复性好、谱带清晰的SSR标记记录结果。在相同迁移位置上，有条带记为1，无条带记为0。利用GeneAlEx 6.4计算观察等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannons信息指数（I）、观察杂合度（Ho）和期望杂合度（He）。多态信息含量PIC=1一∑Pi²。采用Structure 2.3.4软件，对167份西瓜种质的基因型数据进行基于Bayesian算法的群体结构检测，以确定试验群体的数目。通过分析后验概率lnP（ D）值的方差以及变化速率，发现模型的lnP（ D）随着K值的增大持续增加，难以确定真实的K值，因此参照Evanno等的方法通过OK来确定K值。

2 结果与分析

2.1 表型性状遗传多样性分析

2.1.1 质量性状遗传多样性分析西瓜的11个质量性状按照表1进行赋值并进行统计分析，结果见表2。它们的多样性指数变幅是0.54～1.81，平均值为1.16，其中6个性状（果皮底色、覆纹颜色、覆纹形状、果肉颜色、种子颜色、种子覆纹特征）的多样性指数大于1。多样性指数最高的是种子颜色，主要以黄色、红褐色、黑色为主。果实形状大部分为圆形（74.22%），个别（2.13%）是一些畸形的形状。果皮底色主要以浅绿色（32.40%）和绿色（30.80%）为主，白色（0.60%）和黄色（0.60%）属于稀有性状。果肉颜色主要是红色（29.30%）和粉红色（22.30%），也有部分黄色（14.10%）和绿色（4.70%）。大部分种质果实有覆纹（83.70%），其覆纹颜色主要以绿色（28.30%）为主，覆纹形状以条带（30.80%）和网纹（26.20%）为主。大部分种质果实表面光滑（84.00%），个别有沟（12.00%）、棱（3.70%）和瘤（0.20%）。大部分种质果实表面有果粉（70.00%）。大部分种子形状为卵圆（75.88%）;大部分种子没有覆纹（57.38%），有覆纹的种子以黄褐色斑块（14.76%）和黑色斑块（13.10%）为主。

2.1.2 数量性状遗传多样性分析对18个数量性状的分析显示其多样性指数变幅为1.36～2.03表3），平均值为1.71，数量性状的多样性指数普遍高于质量性状的多样性指数，说明西瓜种质数量性状的变异范围更大。7个数量性状的变异系数超过30%，变异系数最大的是边糖含量（90.73%），中心糖含量次之（88.52%），然后依次为果柄长度（58.68%）、果实质量（49.84%）、果皮厚度（36.54%）、种子厚度（35.92%）和种子宽度（34.63%）。其余11个数量性状的变异系数相对较小（16.43%～26.08%，见表3），表明它们在不同的西瓜种质之间变异较小。F测验结果显示，除果皮厚度和种子长度外，其他性状在167个材料之间都具有显著差异，表明不同西瓜种质资源具有明显的表型差异。

2.1.3 不同地区种质资源遗传多样性分析167份种质材料的来源可分为5个生态区域，即北美洲、南美洲、欧洲、亚洲和非洲。笔者研究了与果实相关的13个性状在不同生态区的多样性指数差异（表4）。其中，非洲西瓜种质的表型性状多样性明显丰富（2.216），除了果皮颜色，其他12个性状的多样性指数均高于所有种质相对应的平均值。其次是亚洲（1.785），果肉厚度（3.972）和果皮底色（4.505）多样性指数均为高于其他地区，其他性状的多样性指数都在平均值附近波动。北美生态区除了果肉厚度、果皮底色2个性状外，其他11个性状的多样性指数均高于平均值，北美种质果实形状（0.777）和覆纹形状（1.733）的多样性指数比其他地区都高。而种质较少的南美洲，除了果实形状（0.500），其他性状均低于相应性状的多样性指数平均值。欧洲种质除了覆纹颜色（1.557）和果肉颜色（1.418）的多样性指数高于平均值，其他11个性状的多样性指数均低于相应性状的平均值，且果实形状的多样性指数为0。北美洲、非洲、亚洲、南美洲和欧洲5个生态区种质的平均多样性指数分别为1.725.2.216.1.785、1.146、1.181。所有西瓜种质13个形态性状的平均多样性指数为1.611。由此可见，在西瓜种质中，非洲地区的种质表型多样性最为丰富，亚洲、北美洲次之，南美洲和欧洲的表型多样性相对简单。

2.1.4 基于表型性状的聚类分析根据29个表型性状，利用UPGMA法对167份种质进行聚类分析（见图版A，彩色插页第12页）。在聚类图中，材料165单独位于聚类图的最外层，说明与其他材料的亲缘关系较远。除165外，其他西瓜种质材料可分为4组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。I组共有38份种质，主要来源于北美洲（15）和亚洲（14）;II组共有5份种质，主要来源于非洲（3）;Ⅲ組共有60份种质，主要来源于亚洲（16）和非洲（23）;N组共63份种质，主要来源于亚洲（26）和北美洲（21）。从聚类图可以看出，除了来源于亚洲和非洲的种质相对集中外，不同来源的种质相互交织在一起，并没有按照来源区分开，说明同一类群间种质材料的遗传背景相似度的高低和亲缘关系的远近与来源地无显著相关性，也可能是由于表型数据易受环境影响而造成的误差所导致。

2.1.5 基于表型性状的主坐标分析 对167份西瓜种质的29个性状的统计数据进行标准化处理，采用NTSYS-pc 2.1软件进行主坐标分析（PCoA）（图1）。前3个特征向量解释了34.57%的总变异，第一和第二特征向量分别解释了16.24%和10.04%的变异。所有西瓜种质可根据其PCoA图分为4个区域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），I区69份材料，其中44份来自亚洲，此区种质分布相对集中，说明其种质遗传变异狭窄。Ⅱ区47份材料，其中25份来自非洲，此区种质分布也较集中，但较I区分散，说明其遗传多样性高于Ⅰ区。Ⅲ区33份材料，其中25分来自北美洲，此区种质分布相对分散，说明其遗传变异较丰富。Ⅳ区18份材料，其中5份来自非洲，6份来自亚洲，5份来自北美洲。与聚类结果相似，除来源于亚洲和非洲的种质相对集中外，其他不同来源的种质没有明显区别，再次说明不同来源的种质之间没有明显的差异。

2.2 SSR标记遗传多样性分析

2.2.1 SSR位点遗传多样性分析从480对引物中筛选出22对多态性引物，在167份材料中共获得107个多态性位点（表5），平均每个引物扩增出4.86个多态性位点，引物的等位基因数变化范围为2～8个。等位基因数最多的标记是WMSSR24630和WMSSR26564，均检测到8个。引物的平均有效等位基因数（Ne）的范围为1.37～4.24，平均2.20;各引物的Shannon指数（1）的变化范围是0.54～1.61，平均值为0.94;观测杂合度（Ho）的范围为0.02～0.99，平均值为0.27;期望杂合度（He）平均值为0.52，幅度为0.27～0.770多态性信息含量（PIC）范围为0.25～0.73，平均值为0.45。以上数据表明，22对引物在西瓜种质中具有较好的多态性，SSR检测位点上具有丰富的遗传多样性。

2.2.2 基于SSR位点的Structure分析依据Struc～ture运算结果可将167份西瓜种质划分为4个类群，命名为P1、P2、P3和P4（见图版B，彩色插页第12页）。P1类群含有73份种质（43.71%），主要来源于亚洲（28）和北美洲（26）;P2类群包含64份种质（38.32%），同样主要来源于亚洲（32）和北美洲（20）：P3类群包含17份种质（10.18%），主要来源于非洲（14）;P4类群含有13份种质（7.78%）主要来源于非洲（10）和北美洲（3）。对所有材料的Q值进行分析，发现供试材料中，127份（76.05%）材料的Q值大于0.80，表明其亲缘组成相对单一，40份材料的Q值介于0.492和0.800之间，具有杂合亲缘。

2.2.3 基于SSR位点的聚类分析根据分子标记结果，利用DPS 7.05软件计算各种质间的遗传相似系数，采用UPGMA聚类方法绘制进化树（见图版C，彩色插页第12页），可将167份西瓜种质分为3个类群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），整体来说所选西瓜种质材料具有丰富的遗传多样性。其中，第Ⅰ类群只有2份种质（编号89、90）;第Ⅱ类群共15份种质，全部来源于非洲;第Ⅰ类群和第Ⅱ类群与Structure结果的P3完全一致。第Ⅲ类群共150份种质，对应Structure结果的P1、P2、P4，综上所述，基于UPGMA的聚类结果与 Structure结果基本一致。

2.2.4 基于SSR位点的主坐标分析从主坐标图上可以看出（图2），所有材料明显可以分为2大类群。第Ⅰ类群包括150个材料，对应Structure的P1、P2、P4以及UPGMA的第Ⅲ类群;第Ⅱ类群包括17个材料，对应Structure结果的P3和UPGMA的第Ⅰ和第Ⅱ类群。结果表明，167份种质的主坐标分析结果与Structure结果和UPGMA聚类结果高度致。

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讨论

3.1 西瓜形态学标记的遗传多样性

形态学标记是基于个体外部特征、生理性状及生态地理分布等特征为遗传标记的性状描述，得到的结论往往不够完善，且易受环境的影响，但形态标记比分子标记更直观更容易获得。其中变异系数和多样性是两个反映生物体形态遗传多样性的重要遗传参数。潘存祥等对国内外783份西瓜种质资源24个表型性状进行了遗传研究，发现24个表型性状多样性指数平均值为1.68，平均变异系数为 31.19%，其中种子覆纹颜色变异系数最大（70.90%），第一雌花节位变异系数最小（0.48%）。纪海波对768份西瓜种质资源的13个数量性状和11个质量性状进行研究，其平均多样性指数为1.6，变异系数均值为32.41%，其中种子斑纹形状的变异系数最大（73.32%），开放雌花到茎生长点距离的变异系数最小（0.32%）。前者研究的多样性指数均介于本实验的质量性状（1.16）和数量性状（1.71）之间，而本研究中变异系数的变幅范围为16.43%～90.73%，均高于前者的研究。刘子记等以82份小型西瓜核心种质为研究材料，对6个果实性状进行遗传多样性分析，6个果实性状的多样性指数变化范围在4.29～4.39。石磊分析了来自我国不同区域及国外品种共计50份籽瓜种质样品，39个表型性状的平均变异系数为32.24%，变异系数的范围为6.88%～75.88%，表型性状的多样性平均为5.47，其变幅为2.58～5.64，多样性指数均高于先前的研究。不同的研究结果表明西瓜的表型遗传多样性可能跟试验群體、试验材料来源及表型性状的数量等因素有关。本研究将不同生态区域的多样性进行了比较分析，发现来源于非洲地区的西瓜种质在形态性状，如果实质量、果实纵横径及中心糖含量上差异较大（2.216），说明非洲地区的西瓜种质资源遗传多样性比较丰富，也进一步验证了非洲是西瓜的发源地。来源于亚洲、北美洲、南美洲和欧洲的西瓜种质遗传多样性相对简单，说明了西瓜的遗传基础狭窄，在长期的人工选择和驯化过程中不同材料之间的变异越来越小。

3.2 西瓜SSR标记的遗传多样性

SSR标记是从分子水平揭示西瓜种质资源间的差异，通过选择合适的标记，能够很好地揭示西瓜种质资源的遗传多样性。张法惺等采用38对SSR标记对%份不同生态型西瓜种质进行遗传多样性分析，共扩增出826个多态性条带，平均每对引物21.74个。聚类结果表明野生西瓜与栽培西瓜的亲缘关系较远，聚类结果与本研究相似。赵胜杰等利用22对SSR标记构建了27份中国无籽西瓜主栽品种的DNA指纹图谱并进行了遗传多样性分析。22对多态性引物共扩增出58种基因型，基因数2～5个，平均2.64个。本研究采用22对SSR引物对167份西瓜种质材料进行分析，扩增出107个多态性条带，平均每个引物扩增出4.86个多态性位点，低于张法惺的21.74个，高于赵胜杰的2.64个，这可能与SSR引物自身的多态性和引物筛选标准不同有关。李朋飞等利用SRAP分子标记对80份西瓜种质资源进行遗传多样性分析时，发现来源不同的西瓜材料被划分到一个类群，本研究中表型数据和分子数据的UPGMA聚类结果都表现出这一现象，说明聚为一类的西瓜种质的遗传相似度较高，可能跟西瓜的遗传背景比较狭窄和表型数据易受环境影响有关，因此，西瓜在育种上要加强种质资源的引进与创新。

3.3 2种标记研究遗传多样性的比较

在本研究中，表型标记和SSR标记在167个西瓜种质资源中均表现出良好的多态性，但聚类结果、PcoA结果和Structure结果均不能按照其来源将西瓜群体明显的划分类群。形态学标记的聚类分析与SSR标记的聚类分析结果不一致的现象在之前研究中也有体现。造成这种现象的原因可能是所用的材料没有包括西瓜属的所有类型，表型本身受环境影响较大，或者引种等原因造成的同物异名。因此，在表型调查中通过设置小区重复和多年重复来减少人为和环境因素造成的误差。也可通过加密西瓜染色体上SSR标记更加精确地反映出不同材料间的遗传差异。最后，运用关联分析方法从表型和分子水平进行全面分析，进而得到科学可靠的结果，更准确的评价西瓜种质资源的遗传多样性。