稀释液及稀释倍数对羊精液低温保存效果的研究进展

慕 勇，胡建宏

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）

精液保存技术自发明以来，成为提高优良种畜利用率、加速育种进程最有效的手段之一，为畜牧业发展做出巨大贡献。精液的保存方法分为冷冻保存和液态保存，冷冻保存以实现长期保存，扩大横式的地域种质交流和纵式的品种资源保存。液态保存时间较短，分为常温保存（15～25 ℃）和低温液态保存（0～5 ℃），用以扩大精液量，提高种畜利用率。目前，除了在牛精液冷冻保存技术已经相当成熟，而其他物种（猪、羊、禽等）的精液冷冻保存效果不尽理想。近年来人们将人工授精的工作重点放在液态精液的应用上，特别是猪、马、兔、羊等家畜冷冻精液尚难在生产上推广的现状下，液态保存精液有很大的应用前景。在精液液态保存过程中，人们采用诸多方法如降低能量消耗、抑制精子代谢活动、保护精子线粒体等以达到延长精液保存时间而保持较好受精能力的目的。山羊精液液态保存的适宜温度为2～15 ℃，一般为4～5 ℃最优。迄今为止已有很多稀释液用于山羊精液的液态保存，如柠檬酸钠－卵黄，蔗糖－乙二胺四乙酸（EDTA），柠檬酸钠－果糖－卵黄等。但保存效果都不太理想，保存时间一般在5～72h。国内外关于液态保存山羊精液的研究很多，然而稀释液成分大多比较复杂、繁多，保存效果也并不十分理想，降低了优良种公羊利用率，增加养殖成本。本文针对羊精液低温保存稀释液的成分及其作用、精液的稀释倍数等进行综述，旨在为山羊精液的低温保存研究提供一定的参考。

1 精液低温保存技术

精液的低温保存是指将稀释处理好的精液在0～5 ℃条件下保存。其原理是通过降低温度，使精子代谢活动减弱，当温度降至0～5 ℃时，精子代谢较弱，几乎处于休眠状态，此时精子的物质代谢和能量代谢水平降到最低，废物积累减少。而且低温保存条件还能有效抑制有害微生物的生长，有利于精子生存，从而延长精子的存活时间。低温保存的精液，当温度回升后，能恢复正常代谢机能而不丧失受精能力。精液在稀释过程中精液的成分发生改变会引起精子理化性质的变化，甚至有可能对精子带来致命打击，精液温度降低时精子也会因受到冷打击而造成精子冷休克。因此好的的保存稀释液是人工授精技术得以顺利实施的关键。合理的选择稀释液成份以及正确的稀释方法和稀释倍数是保障低温保存效果优良的技术关键。

2 稀释液的主要成分和生理作用

稀释液作为精子的生活环境，其目的是抑制精子代谢活动，降低能量消耗，从而延长精子保存时间而不使其丧失受精能力。在低温条件下，稀释液的主要作用就是为精子提供能量，优化精子所处环境的渗透压及pH，防止精子细胞内磷脂的流失并起到抗冷休克的作用，去除高度稀释对精子的负面影响，防止细菌污染，给精子适应外界环境创造有利条件。因此，良好的稀释液应具备以下功能：提供精子运动所需能量；抵抗冷休克；缓冲pH 变化；平衡渗透压和电解质；抑菌杀菌；扩大精液量。

2.1 糖类

精子的存活和维持运动需要消耗能量，糖类作为能源物质，可为精子提供营养，补充精子能量。大量研究证明，精子不能直接利用外界营养物质，而主要靠分解精子细胞内部的物质来获取能量。小分子糖类（如葡萄糖、果糖）能穿过精子质膜为精子代谢提供能量，而大分子糖类（如蔗糖、海藻糖和葡聚糖）不能穿过精子质膜，但能调节渗透压，维持质膜稳定性，以利于精子的存活［1］。稀释液中常用葡萄糖和果糖为精子补充能量，赵本田等［2］认为山羊精液保存时以只含葡萄糖时保存效果最好。徐振军等［3］对绒山羊精液低温保存研究中发现，稀释液中添加蔗糖和乳糖对维持精子活力和保护精子顶体并没有显著效果，认为该两种糖的添加使稀释液粘稠度增加，降低了精子的活力。Salamon等［4］研究认为，在液态保存中，蔗糖等二糖并不为精子提供能量，只是起到在维持胞外渗透压、保护质膜的作用。

2.2 缓冲物质

正常情况下，山羊精液呈弱酸性或中性，pH 为6.8～7.0 之间。为防止稀释过程及稀释后使精液pH 发生巨变，稀释液中需添加缓冲剂来维持酸碱度的相对稳定，维持精子生存环境的相对稳定，防止精子因过酸而死亡。稀释液中可用的缓冲剂有柠檬酸、柠檬酸钠、碳酸氢钠、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、HEPES（4－羟乙基哌嗪乙磺酸）等。其中Tris的缓冲效果最好，Tris不仅有良好的缓冲性，而且高浓度对精子的毒性也很低［5］。HCO3－过量可能使精子质膜结构发生改变诱发获能［6］，HEPES 等两性有机物可以鏊合部分有害金属离子，缓冲能力较其他缓冲剂强且不受温度影响［7］。Newth 等［8］认为现配稀释液pH 在60～90min内不稳定，随时间变化，不同稀释液的pH 变化规律相异。

2.3 卵黄

生存环境温度的降低会使精子受到冷打击而休克，失去受精能力。卵黄被用作常规保护剂广泛应用于各种动物的精液稀释，低温保存时向稀释液添加卵黄可以对精子提供热保护，而茆达干等［9］认为添加卵黄会使波尔山羊精液保存时间缩短，卵黄对羊精子有一定的副作用。卵黄作为动物源性的添加剂，必然不可避免微生物的污染，另外山羊精清中含有卵黄凝集因子，与卵黄产生凝集作用。因此在山羊精液保存中应合理添加卵黄，大量研究显示将卵黄浓度从20%下降至5%不会影响受胎率，而进一步降低卵黄浓度，受胎率将会下降［10］。卵黄中为精子提供保护的主要物质是卵磷脂（PC），PC 熔点低，低温不易冻结，保护精子生存，还有改善细胞脂类代谢，提高细胞抗氧化能量等多重优点。胡传水等［11］用大豆卵磷脂代替卵黄后保存猪精液，结果表明以1.5%卵磷脂效果最佳。奶类也是常用低温保护剂，研究发现，绵羊精液液态2～5 ℃保存条件下，脱脂乳的效果优于全乳，若在脱脂乳类稀释液中添加1%的葡萄糖和5%的卵黄可提高精子活力，而脱脂乳保存的精液要保证好的受胎率则须在8～10h内输完精［12］。

2.4 抗生素

一般情况下，新鲜精液基本无菌，但在稀释过程中无可避免的会引入一些杂菌，细菌的污染会造成精子凝集、顶体破坏、pH 下降等一系列不利影响。添加适量抗生素可改善精液保存效果，提高受胎率。传统的稀释液以使用青霉素为主流，后来研究认为青霉素与链霉素联合使用效果更佳。另有研究指出，精液保存时可能造成影响的细菌种类繁多以大肠杆菌危害最甚，其能使精子短时间内失活，还会破坏顶体质膜［13］，而青、链霉素对革兰氏阳性菌抑杀效果显著，对大肠杆菌却没有效果。吴结革等［14］研究证实，用恩诺沙星保存精液的效果确实比使用青、链霉素等效果好，其适宜使用量为50μg／mL。

2.5 抗氧化物

抗氧化剂在精液保存中发挥的作用越来越引起人们关注。精子区别于其他细胞，胞内缺乏抗氧化物质，精子质膜中又没有足够的脂肪酸类物质，致使精子易受氧化损伤，精液稀释保存操作过程中，有氧和可见光环境加速氧化作用，精子活力和质膜完整率受到影响，此时添加抗氧化物可以有效克制这种损伤［15］。在稀释液中添加褪黑激素（MLT）和超氧化物歧化酶（SOD），能够延长精子存活时间，过氧化氢酶（CAT）提高山羊精子膜完整率和顶体完整率［16］。孙琪［17］研究表明，在稀释液中添加适量的谷胱甘肽（GSH）、褪黑激素（MLT）、丁羟甲苯（BHT）均能提高猪精液的保存效果。

2.6 其他成分

血清蛋白（BSA）是一种蛋白类保护剂，能有效地延长精液保存时间，提高保存后精子的受精能力。Matsuoka等［18］研究羊精液冷冻保存表明，用10%～15%的BSA 能起到跟卵黄相当的保护作用。赵本田等［2］研究认为，含5% PVA（聚乙烯醇）的稀释液有利于精液保存，PVA 的烯醇式结构与水分子氢形成氢键，改变液体表面张力，利于平衡精子质膜内外的作用力。Ca2＋内流能引起顶体反应，启动精子获能，不利于保存，故配制稀释液应使用去离子水，同时也可添加适量EDTA 等螯合剂减少稀释液中的有害金属离子［19］。陈宗明等［20］研究了维生素C对贵州黑山羊低温保存精液品质的影响，添加维生素C 3.0mg／mL 时，可以显著提高贵州黑山羊的精液品质，张培松等［21］用维生素B12稀释小尾寒羊精液，5～10 ℃下保存，发现维生素B12能显著提高精子的有效存活时间，精子有效存活时间（活力高于0.6）和最长存活时间（90%精子死亡时间）特别是以1∶3比例稀释时可以分别达到22h 和49h 而不含维生素B12的稀释液有效存活时间和最长存活时间仅为7h 和17h。

3 精液稀释倍数

精液稀释时使小分子蛋白、自然抗氧化剂、脂肪酸类物质等重要成分的浓度降低，导致精子聚集、结构受损，缩短精液保存时间，高倍稀释后对精子的存活时间、受精能力都有不良影响［22］。但稀释精液能使其中抑制精子获能的物质浓度降低，有利于精子获能。王柏山等［23］研究表明，稀释倍数在10 倍以下，可以获得比较高的受胎率，7、10倍稀释与原精液受胎率差异都不显著，15倍稀释与原精液受胎率差异极显著，一次输入有效精子数30×106个以上受胎效果好。李助南等［24］研究表明，山羊精液稀释倍数应以2～5倍为宜；徐振军等［25］采取6～8倍稀释，并未出现不良影响；刘福元等研究报导精液保存以8倍稀释为佳［26］。

4 存在问题与展望

山羊的繁殖具有明显的季节性，如果生产中不使用激素进行同期发情处理，则羊的发情不集中，繁殖周期拉长，采集羊精液麻烦，使用液态精液保存是克服这一矛盾最便捷的办法。用液态低温保存精液，由于保存简单，技术容易掌握，因而其具有广阔的应用前景。

山羊精液低温保存技术虽然已进入应用阶段，然而保存稀释液的配方不尽完美，保存方法不够完善，精液在保存过程中其活力和受精能力受到诸多因素的影响，如氧化损伤、代谢酸化、DNA 断裂、精子质膜蛋白和脂类组分发生变化、顶体反应以及自发获能等，导致精液的保存时间短，人工授精受胎率低，该技术的优势未能得到长足的发挥，极大程度的限制了该技术的推广应用。因此，深入研究羊精液保存技术，开发新型稀释液配方，减少精液保存过程对精子的损伤，以构建更适宜精液体外生活的环境。

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