翻堆对蛋鸡粪堆肥甲烷排放的影响

刘俊专，王 燕，廖新俤，吴银宝，胖 是

（华南农业大学动物科学学院，广东广州510642）

随着全球温室效应的日益加剧，温室气体研究备受各国学者关注。甲烷（CH4）作为重要的温室气体之一，其增暖潜势约是二氧化碳（CO2）的23 倍，对全球变暖的贡献率为19%，仅次于CO2（55%），且甲烷排放每年正以0.9%的速度持续增加［1］。农业生产是CH4的重要排放源，40%的CH4排放源于农业生产［2］。其中畜禽粪便是最为重要的排放源之一，全球约有9%的生物性CH4源于畜禽粪便的管理和应用过程中［3－5］。因此研究畜禽粪便管理利用过程中甲烷排放对全球甲烷减排，减轻全球温室效应具有重要意义。

堆肥是实现畜禽粪便无害化、减量化和资源化的主要途径，同样也是减少畜禽粪便温室气体排放的重要方式［6－7］。在堆肥过程中甲烷排放约占初始总有机碳的0.01%～8.0%［4］。翻堆可以促进堆体升温、物料降解及腐熟，但也可能影响CH4 排放。近年研究表明，翻堆可显著减少CH4的排放［8－9］；而也有学者研究发现，翻堆会增加CH4的排放［6，10］。这可能是因为不同研究采用的翻堆频率不同，从而导致翻堆对CH4排放产生不同影响。但目前鲜见专门研究翻堆对CH4排放影响的相关报道。因此，本试验通过设定不同的翻堆频率，研究其对CH4排放所产生的影响，并对影响CH4生成的微生物菌群进行分析，为堆肥过程中合理翻堆及CH4减排提供依据。

1 材料与方法

1.1 堆肥原料与试验分组

新鲜的蛋鸡粪便采自中山市白石鸡场产蛋鸡舍，传输带收集粪便、打包，第2天运输至试验现场。锯末购自河源市东源县某木材加工厂。堆肥原料主要成分见表1。将鸡粪和锯末按鲜重湿重比为7.64︰1，控制堆体物料初始重约150kg，初始C／N 为10左右，含水率68%。

按照4 次／d、2 次／d、1 次／d、1 次／3d、1 次／6d和不翻堆6个不同翻堆频率，分为A、B、C、D、E 和F（对照组）6个处理。A 组每天09︰00、15︰00、21︰00和03︰00翻堆，B 组每天09︰00和21︰00翻堆，其他各组在翻堆当天的09︰00翻堆。试验时间为40d。

1.2 堆肥设备

采用自行设计的动态箱式堆肥试验装置，内部配有搅拌装置以及温度探头，对堆肥过程中的温度实时监测。堆肥箱长×宽×高为60cm×60cm×80cm，体积为288L。箱体结构见图1。

表1 堆肥原料的主要成分Table 1 Main component of composting material

图1 动态箱式堆肥试验装置结构图Fig.1 Structure diagram of dynamic box composting test device

1.3 测定指标及方法

1.3.1 气样采集及CH4浓度测定 堆肥前15d，每天分别在09︰00～10︰00、14︰00～15︰00和20︰00～21︰00 3个时间段，收集1h内由箱体出气口排出的所有气体，混匀后用1L 铝箔袋采集气样，用于测定CH4浓度。

采用安捷伦气相色谱仪（7890A）FID 检测器测定CH4浓度，色谱柱采用Agilent19091P－Q04。CH4排放量的计算公式如下：

F＝（C1－C2）V

式中：F 为CH4排放量（mL），C1为出气口CH4浓度（μL／L），C2为进气口CH4浓度（μL／L），V 为出气口总流量（m2）。

1.3.2 总DNA 提取 堆肥样品微生物总DNA 采用OMEGA 公司E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit试剂盒提取。

1.3.3 产甲烷菌普通PCR 扩增 以总DNA 为模板，采用巢式PCR 法进行扩增，试验所用引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。首先采用Met86F和Met1340R 为引物（表2）［11］，扩增产甲烷菌16SrRNA 基因片段，目的片段大小为1 254bp，反应体系采用25μL 的扩增体系，其中Premix Ex TaqTM Version2.0 12.5 μL，引物Met86F（10 pmol／μL）0.5μL，引物Met1340R（1 0pmol／μL）0.5μL，DNA 模板0.5μL，加无菌ddH2O 至体积25μL。PCR 条件为95 ℃预变性3min，95 ℃变性30s，54℃复性30s，72℃延伸80s。34个循环，最后72 ℃延伸10min，然后4 ℃保温，反应结束后取5μL PCR 产物用2%琼脂糖凝胶于130V 电泳23 min，然后通过凝胶成像系统观察PCR 产物，并拍照记录，确认PCR 扩增出目的产物后用于下一步PCR 的模板；再采用产甲烷菌的特异性引物对GC－Arc344F 和519R（表2）［12］，扩增产甲烷菌16S rRNA 基因上的V3可变区，用于DGGE 分析。反应体系采用50μL 的扩增体系，其中Premix Ex TaqTM Version2.0 25.0μL，引物GC－Arc344F（10 pmol／μL）1.0μL，引物Arc519R（10pmol／μL）1.0 μL，DNA 模板1.0μL，加无菌ddH2O 补充体积到50μL。PCR条件为95℃预变性3min，95℃变性15 s，56℃复性30s，72℃延伸30s。34个循环，72℃延伸7min，然后4℃保温，反应结束后取5μL PCR产物用2%琼脂糖凝胶于130V 电泳23min，然后通过凝胶成像系统观察PCR产物，并拍照记录。

表2 产甲烷菌的引物序列Table 2 Primer sequence of methanogens

1.3.4 实时荧光定量PCR 将已知浓度的产甲烷菌质粒DNA 用双蒸灭菌水按1∶10 倍稀释8个梯度，每个梯度3个重复，同时作3个阴性对照，进行实时荧光定量PCR 反应。采用引物GC－Arc344F 和519R（表2）［12］，采用20μL反应体系，其中10pmol／μL的引物各0.5μL，2×SYBR Green qPCR Supermix 10μL，超纯水8μL。95 ℃预变性1min，变性15s，52℃退火30s，72℃延伸25s，循环40次。反应结束后，由溶解曲线判定PCR反应的特异性，根据荧光曲线的Ct值以及标准曲线技术定量结果［13］。

堆肥样品中产甲烷菌拷贝数计算公式如下：

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，多重比较采用邓肯极差检验法，显著水平P值设为0.05。

图2 各处理甲烷排放总量Fig.2 Total methane emission of different treatment

2 结果与分析

2.1 CH4 排放总量

由图2可见，翻堆频率为4次／d（处理A）、2次／d（处理B）、1次／d（处理C）、1次／3d（处理D）、1次／6d（处理E）和不翻堆（处理F）时，甲烷排放总量分别为28.60L、50.07L、70.85L、76.48L、90.74 L和59.33L。本试验中，甲烷排放量最高的翻堆频率为1 次／6d（E 组），最低的翻堆频率为4 次／d（A 组）。与不翻堆相比，在高翻堆频率下（4 次／d和2次／d），甲烷的排放量减少，且随翻堆频率的增加而甲烷排放量降低。

图3 甲烷排放量随堆肥时间的变化Fig.3 Methane emissions in different composting time

2.2 CH4 排放量随堆肥时间变化

如图3所示，各处理在堆肥初期甲烷排放量最大，这与很多学者的研究结果一致［6－7，14－15］。随堆肥时间的延长，甲烷排放量基本呈逐渐下降的趋势，但B、C组在9至11d出现一个甲烷排放小高峰，可能与B、C组此时温度上升较快有关。

堆肥前12d，各组甲烷排放量大小顺序为A＜B＜D＜E＜F＜C，方差分析表明：堆肥前12d各组甲烷排放量差异不显著（P＞0.05）。但从堆肥第13 d至结束各组甲烷排放量大小顺序为A＜B＜F＜C＜D＜E，A 组显著低于C、D、E 组（P＜0.05），B 组显著低于D、E组（P＜0.05），F组显著低于D、E 组（P＜0.05），C 组显著低于D、E 组（P＜0.05）。上述分析表明，翻堆对堆肥升温期甲烷的排放没有显著影响，但在堆肥高温期和降温期，高频翻堆会显著降低甲烷的排放，翻堆频率越低甲烷排放量越大。

图4 翻堆后和翻堆前1h甲烷排放强度对比Fig.4 Comparison of methane emission before and after turning within 1hduring composting

2.3 翻堆前后CH4 排放强度差异

图4是不同天数翻堆前后1h内收集的气体中甲烷浓度的比较。由图4知，各处理翻堆后甲烷浓度均高于翻堆前，且翻堆频率较低（1 次／3d 和1次／6d）时，翻堆前后浓度差别最大。说明翻堆会促进甲烷的挥发，翻堆后甲烷排放强度会增大，在翻堆频率较低时，翻堆后甲烷排放强度增加越多。

2.4 产甲烷菌多样性

堆肥过程中各组产甲烷菌多样性指数H′的变化见表3。由表3可知，各组产甲烷菌多样性指数H′的变化趋势基本一致，在堆肥开始时各组产甲烷菌多样性指数H′为2.38～2.67之间，在堆肥中期由于堆体温度较高，产甲烷菌活性受到抑制，各组产甲烷菌多样性指数H′明显下降，到堆肥后期，由于堆体温度的下降，各组产甲烷菌多样性指数H′又开始升高。

在整个堆肥过程中，各组产甲烷菌多样性指数H′大小顺序为C＜A＜B＜D＜F＜E。方差分析表明：各组产甲烷菌多样性指数H′差异显著（P＜0.05）；E组显著高于A、B、C、D 组（P＜0.05），F 组显著高于A、B、C组（P＜0.05），其它各组之间差异均不显著（P＞0.05）。上述分析表明，高翻堆频率会降低产甲烷菌的多样性，这也可能是高翻堆频率降低甲烷排放总量的主要原因。

表3 各组产甲烷菌多样性指数H′的变化Table 3 Changes of methanogens diversity index H′

2.5 产甲烷菌总量

各组产甲烷菌拷贝数介于1.77×104～7.02×107copies／g DM 之间（表6）。且各组产甲烷菌拷贝数随堆肥时间的变化规律基本一致，均表现为堆肥初始产甲烷菌含量最高，然后快速下降，在堆肥的6～12d 后，开始缓慢上升。这可能是因为堆肥初始，堆体内的产甲烷菌尚未适应堆体环境，产甲烷菌数量迅速下降，当适应之后，又受堆体温度的升高及堆体可利用碳源和氮源的限制，而缓慢增加。整个堆肥过程中，各组产甲烷菌拷贝数对数值A 组＜B组＜F组＜C 组＜D 组＜E 组，方差分析表明：差异显著（P＜0.05）。A 组显著低于其他各组（P＜0.05），B组显著低于C、D、E 组（P＜0.05），F 组显著低于E组（P＜0.05），其他各组差异不显著（P＞0.05）。说明在高翻堆频率下，翻堆可显著降低产甲烷菌的数量；而在低翻堆频率下，翻堆会增加产甲烷菌的数量。这与高翻堆频率会减少CH4的排放，而低翻堆频率会增加CH4的排放的结果相一致。

表4 各组产甲烷菌总量Table 4 Total methanogens among different treatment copies／g DM

3 讨论

本研究中，与不翻堆相比，高翻堆频率能减少甲烷的排放量，且随翻堆频率的增加而甲烷排放量降低，低翻堆频率增加了甲烷的排放。这可能有以下两个原因：（1）在高翻堆频率下，堆体内氧气浓度上升较快，堆体内大部分区域氧气浓度较高，抑制了甲烷的生成［5－7］。低翻堆频率下堆体氧气浓度较低，堆体大部分区域处于厌氧状态，适合产甲烷菌活动产生甲烷，而翻堆促进了甲烷的挥发，同时堆体内的甲烷能被甲烷氧化细菌氧化，而翻堆促进了甲烷的挥发，使被氧化的甲烷减少，从而促进甲烷的排放［4］。（2）通过影响产甲烷菌多样性及总量来影响甲烷排放。荧光定量PCR 研究表明，产甲烷菌数量的研究表明高翻堆频率可显著降低产甲烷菌的数量；而低翻堆频率会增加产甲烷菌的数量。这与高翻堆频率会减少CH4的排放，而低翻堆频率会增加CH4的排放的结果相一致。可能是因为翻堆频率越高，前期堆体温越快，越有利于堆体物料降解，且翻堆频率越高高温持续时间越长。而高温期持续时间越长，对产甲烷菌活性的抑制作用也越强，导致高翻堆频率显著降低产甲烷菌的多样性指数和产甲烷菌的总量，从而降低了甲烷的排放。同时高翻堆频率还促进了蛋鸡粪堆肥含水率的降低，而高含水率会降低堆体的通气性能，降低了堆体的烟囱效应，进一步导致了堆体内部氧气缺乏，从而导致低翻堆频率甲烷排放增加。

不同天数翻堆前后1h内收集的气体中，各处理翻堆后甲烷浓度均高于翻堆前，且翻堆频率较低（1次／3d和1次／6d）时，翻堆前后浓度差别最大。说明翻堆会促进甲烷的挥发，翻堆后甲烷排放强度会增大，在翻堆频率较低时，翻堆后甲烷排放强度增加越多。这主要是因为翻堆促进了堆体内部气体的交换，使堆体内的甲烷大量挥发，导致翻堆后甲烷排放强度的短暂增大，而低翻堆频率时，堆体处于厌氧状态区域更大，堆体内蓄积的甲烷更多，因此翻堆后排放强度大幅增加。

4 结论

在蛋鸡粪和锯末堆肥过程中，堆肥初期CH4排放量最大，翻堆对堆肥升温期CH4的排放没有显著影响，但在堆肥高温期和降温期，与不翻堆相比，高翻堆频率（4次／d和2次／d）会减少CH4的排放，而低翻堆频率（1次／3d和1次／6d）会增加CH4的排放。同时，高翻堆频率会显著降低产甲烷菌的多样性指数和产甲烷菌的总量，而低翻堆频率显著增加了产甲烷菌的总量，这可能是导致在不同翻堆频率下，CH4排放量变化的重要原因。

综合不同时期翻堆对CH4排放量、堆肥进程以及成本的影响，2次／d可以降低甲烷的排放，为较合适的翻堆频率。

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