10味中药对畜禽支原体敏感性及细胞毒性研究

陈美安，甄汉深，裴渭静，赵 欣，沈永强，唐旭东＊

（1.成都中医药大学，四川成都611137；2.深圳清华大学研究院创新中药及天然药物研究重点实验室，广东深圳518057；3.广西中医药大学，广西南宁530001；4.广东高山动物药业有限公司，广东信宜525300）

近年来，我国各禽畜支原体病频繁发生，猪支原体导致的猪气喘病的感染率、发病率居高不下，有的地方已达90%；鸡毒支原体感染阳性率为50%～80%，牛支原体病及羊支原体病感染率也明显增加，给养殖业造成了巨大的经济损失。目前预防与治疗动物支原体病主要采用抗生素类药物，虽然一些抗生素药物对动物支原体有较好的治疗作用，但是所产生的耐用现象愈来愈严重，给临床治疗增加了困难。而我国中草药具有药源广、价格低、毒副作用小、不易产生耐药性的特点，近年来已得到人们的关注，其在畜禽支原体病临床治疗上具有很好的开发和应用前景。因此本研究采用微量液体稀释法［1－13］测定抗菌中药对畜禽支原体的敏感性，并结合体外细胞毒性试验，评价其抗支原体活性，为兽医临床用药提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 牛支原体标准株－PG45株、鸡毒支原体标准株－BG44T 株、羊肺炎支原体标准株－Y－98株及非洲绿猴肾细胞（Vero 293细胞）均由哈尔滨兽医研究所辛九庆研究员提供。

1.1.2 试 药 两面针、广藿香、南板蓝根、黄连、黄芩、黄柏、甘草、白鲜皮、土槿皮、艾叶等10味中药饮片均购自深圳万泽医药连锁有限公司。

1.1.3 主要试剂与仪器 KM2基础培养基、PPLO基础培养基、高糖DMEM 培养基、马血清、胎牛血清、青霉素、链霉素、0.4%酚红、磷酸盐缓冲液（PBS）（均购自Gibco 公司），3－（4，5－二甲基噻唑基）－2，5－二苯基四氮唑溴盐（MTT）（Sigma公司）、二甲基亚砜（DMSO）（均购自Sigma公司），0.25%胰酶（Typsin）（Hyclone 公司）。超净工作台（ZHJH－1112C，郑州南北仪器设备有限公司）、二氧化碳恒温培养箱（DHP－9032，哈尔滨东联电子技术开发有限公司）、酶标仪（Plus 384型，美国）、倒置显微镜（CX41－32C02，OLYMPUS ）、离心机（湘仪TDZ5－WS，湖南湘仪离心机仪器有限公司）、96 孔细胞培养板（购自兰州科迈公司）等。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制 KM2培养基的配制：取KM2基础培养基，加适量马血清、0.4%酚红及青霉素等所需物，调整PH 值至7.6，0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，即得，4 ℃保存备用。

PPLO 培养基的配制：PPLO 基础培养基，加适量胎牛血清、0.4%酚红及青霉素等所需物，调整PH 值至7.8，0.22μm 微孔滤膜过滤除菌，即得，4℃保存备用。

1.2.2 0.5% MTT 的配制 称取0.5g MTT，溶于100mL 磷酸盐缓冲液（PBS，PH 7.4）中，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，用铝箔纸包住容器，置4 ℃避光保存即可。现用现配，过滤后4 ℃避光保存2周内有效。当MTT 变为灰绿色时不可再使用。

1.2.3 中药70%乙醇提取物制备 取中药饮片，粉碎，过10目筛，得中药粗粉。称取中药粗粉20g，加入10倍量70%乙醇，浸泡0.5h，回流提取3次，每次1.0h，合并3次提取液，定量过滤，浓缩并真空干燥得干浸膏。试验前用相应培养基配成浓度为每1mL 提取液中相当于含生药量2g 的中药原液，0.22μm微孔滤膜过滤，4 ℃冰箱保存，备用。（注：药敏试验前需用50%枸橼酸钠调pH 至7.6～7.8）

1.2.4 药敏试验

1.2.4.1 支原体培养及颜色变化单位（CCU）测定

将冻干标准支原体株加到相应液体培养基中，牛支原体PG45株加到PPLO 培养基中，鸡毒支原体BG44T 株及羊肺炎支原体Y－98 株均分别加到KM2培养基中，置37 ℃，5%CO2，相对湿度为80%～90%培养箱中培养约7d，使其连续传代，取第3代对数生长菌液（牛支原体PG45 株为1×108CCU／mL、鸡毒支原体BG44T 株为1×109CCU／mL、羊肺炎支原体Y－98 株为1×1010CCU／mL），用相应液体培养基稀释至1×104CCU／mL，作为工作菌液。

1.2.4.2 最小抑菌浓度（MIC）

（1）加培养基：取96孔细胞培养板，于每排第1孔加入培养基150μL，第2～11孔加入培养基100μL，第12孔加入培养基200μL。

（2）加药液：于第1孔加入药液50μL，并用微量加样器从第1孔开始2倍倍比稀释药液至第10孔，混匀后于第10孔吸出100μL弃去。

（3）加工作菌液：第1～11孔加入工作菌液100μL，使得所有孔的液体总体积为200μL，药物的终浓度从第1～10 孔依次为（单位：mg／mL）250.00、125.00、62.50、31.25、15.625、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49，共10个稀释梯度，第11孔为阳性对照孔（即生长对照孔），第12孔为阴性对照孔。

（4）培养：滴入无菌液体石蜡密封，盖上板盖，置恒温培养箱内37℃，5%CO2，相对湿度为80%～90%孵育。当阳性对照孔发生颜色改变（即培养液中酚红指示剂由红色变为黄色或橘黄色）且无混浊，加药孔不再出现颜色变化时判定一次结果（发生颜色变化的前1 管的药物稀释浓度为最小抑菌浓度MIC）；5d后，所有孔不再发生颜色变化再判定一次结果。每味中药平行重复3次试验。

1.2.4.3 判定标准 目前，国内外对中药抗支原体的最小抑菌浓度（MIC）仍无统一标准，故根据同类试验文献报道［3－5］的判断标准为依据进行判定，即MIC≤7.81mg／mL 时较为敏感，MIC 为7.81～250 mg／mL 时为中度敏感，当MIC＞250 mg／mL时为不敏感。

1.2.5 体外细胞毒性试验

1.2.5.1 Vero293 细胞培养 将冻干标准Vero 293细胞加到含10%胎牛血清、1×104IU 青霉素和1×104IU 链霉素的高糖DEME 培养基中，置37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.5.2 Vero293细胞传代及计数 将Vero 293细胞培养瓶内的培养液弃去，小心用适量PBS把贴壁细胞洗2～3次后，加少量0.25%胰酶，置37 ℃，5%CO2培养箱中温孵3～5 min；待细胞消化完毕后，加适量的培养基终止消化，并反复轻轻吹打细胞，制成均匀的细胞悬浮液；最后加适量培养基，并分装于新的培养瓶中，置37 ℃，5%CO2培养箱中培养2～3d，倒置显微镜下观察，并进行计数。

1.2.5.3 体外细胞毒性测定 取健康Vero 293细胞培养液，接种于无菌96 孔细胞培养板，200μL／孔，保证细胞个数为1×104个／孔，5% CO2，37 ℃孵育，培养24h，至细胞完全贴壁。加入浓度梯度的药液，每孔100μL，平行设6个复孔，于5%CO2，37 ℃孵育24h，显微镜下观察细胞情况。每孔加入0.5%MTT 溶液20μL，继续培养4h。如果药物与MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲洗2～3次后，再加入含MTT 的培养液。终止培养，轻轻吸去孔内培养液，每孔加入二甲基亚砜150μL，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解后，于酶联免疫检测仪OD490nm 处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔即空白对照组（培养基、MTT、二甲基亚砜），细胞对照组（不含药物组）。根据半数抑制浓度（IC50）和最大安全浓度（TC0）来评价中药对Vero 293细胞的细胞毒性作用。

1.2.5.3 数据处理 用统计学软件SPSS13.0对所测OD 值的平均值±标准差（）进行显著性检验，P＜0.05具有显著统计学差异。取6个平行复孔的平均值，计算药物对细胞的抑制率。抑制率＝（细胞对照组OD 值－加药组OD 值）／（细胞对照组OD值－空白对照组OD 值）×100%。选取细胞抑制率小于5%的药物浓度为该药的最大安全浓度（TC0）。

2 结果

2.1 药敏试验结果

10味中药中，7味中药对3种畜禽支原体均具有不同程度的体外抑制和杀灭作用，均属于中度敏感范畴，其中两面针MIC值最小，其次甘草和黄柏。另外3味中药广藿香、土槿皮和艾叶MIC 值均大于250mg／mL，即对3种畜禽支原体几乎不敏感。结果见表1。

表1 10味中药70%乙醇提取物体外抗畜禽支原体MIC值（n＝3）Table 1 MIC of 70%ethanol extracts of ten kinds of traditional Chinese medicine on livestock and poultry mycoplasma（n＝3）mg／mL

2.2 体外细胞毒性试验结果

由表2 及图1 可知，加药组和细胞对照组的OD 值，与空白对照组比较，P＜0.05，均具有显著统计学差异，表明加药组和细胞对照组均有细胞存活。经测定，两面针、广藿香、南板蓝根、黄连、黄芩、黄柏、甘草、白鲜皮、土槿皮和艾叶等10味中药的TC0（单位：mg／mL）分别为3.91、15.625、7.81、3.91、7.81、7.81、7.81、7.81、＜0.49、3.91，IC50（单位：mg／mL）分别为43.62、93.27、84.99、47.20、79.34、81.94、104.55、83.79、3.12、49.68。当两面针、甘草、白鲜皮和艾叶浓度≤0.98mg／mL，广藿香浓度≤3.91mg／mL，南板蓝根、黄连、黄芩和黄柏浓度≤1.95mg／mL，土槿皮浓度＜0.49 mg／mL 时，其OD 值与细胞对照组无显著性差异（P＞0.05），说明10味中药在上述各浓度范围内对Vero细胞无明显的细胞毒性，且随着药物浓度的降低，OD 值增加，药物对细胞抑制率降低；当药液高于自身TC0时，OD 值则显著低于细胞对照组（P＜0.05），且随着浓度增加，OD 值明显下降，抑制率也相应增加，表明在高浓度范围内中药药液对细胞具有不同程度的毒性作用，随着浓度的增加毒性显著增强。故可推断中药浓度与OD 值和抑制率之间存在显著相关性。

表2 10味中药70%乙醇提取物对Vero细胞毒性测定结果（n＝6）Table 2 Cytotoxicity of 70%ethanol extracts of ten kinds of traditional Chinese medicine on vero cells（n＝6）

图1 10味中药70%乙醇提取物对Vero细胞抑制曲线Fig.1 Inhibition curves of 70%ethanol extracts of ten kinds of traditional Chinese medicine on vero cells

3 讨论

支原体为兼性厌氧微生物，培养条件最好在37～38 ℃，5%～10%CO2和相对湿度为80%～90%的环境下培养。药物对支原体的MIC测定结果与接种物浓度有很大关系，临床上动物体内的支原体含量约为1×104CCU／mL，故本试验采用1×104CCU／mL作为支原体工作浓度，保持其他实验条件一致性，以确保实验结果的重复性和准确性并具有较好的临床意义。试验用支原体生长的pH 范围在7～8之间，以7.6～7.8最佳，为避免试药本身pH 对支原体的生长繁殖产生影响而干扰试验结果，故测定前需先用5%枸橼酸钠将试药pH 调至与培养基的pH 一致，即pH7.6～7.8。

畜禽支原体病主要以呼吸道感染为主，兽医临床用中药治疗主要以清热解毒、清热燥湿及祛风杀虫为主。本试验主要选用具有清热解毒、清热燥湿、祛风杀虫功效的10味中药70%乙醇提取物对牛支原体PG45株、鸡毒支原体Bc44T 株及羊肺炎支原体Y－98株的敏感性研究，结果表明两面针、南板蓝根、黄连、黄芩、黄柏和甘草这7味中药均具有不同程度的体外抑制和杀灭作用。根据同类试验文献［5－7］的判断标准，7 味中药对畜禽支原体均属于中度敏感范畴。其中两面针（3.91mg／mL≤MIC≤15.625mg／mL）、甘草（7.81mg／mL≤MIC≤31.25mg／mL）和黄柏（15.625mg／mL≤MIC≤62.50mg／mL）敏感性较好；其余3味中药广藿香、土槿皮和艾叶活性最低，MIC均大于250 mg／mL。同时，对空白试剂5%枸橼酸钠做了测定，发现其对畜禽支原体生长无影响。在实验中发现有些中药溶液本身具有一定颜色，使得培养基颜色变深，用肉眼判断其颜色变化，可能会导致实结果误差。因此需要进行多次重复试验，以得到准确的实验数据，其实际操作工作有待进一步完善。

根据单味中药抗支原体活性初步筛选结果，本试验还结合细胞毒性试验，以筛选出理论上可用于临床的无毒或低毒的抗支原体中药。本试验采用的是MTT 法测定中药对Vero细胞的细胞毒性，MTT 法是反映活细胞数量的方法，其原理是MTT 被代谢旺盛的活细胞线粒体脱氢酶还原成的蓝色甲簪结晶就越少，甲簪被溶解后所测得的光密度值就越小，说明细胞存活率低。细胞毒性试验结果表明土槿皮对Vero细胞有一定的细胞毒性，文献记载［16－17］其多作为外用药使用，故因慎用或遵医嘱用药；其他中药细胞毒性很小，对筛选出具有较好抗支原体活性中药具有重要的意义。中药化学成分多而复杂，中药在体内的作用比体外要复杂很多，药物进入机体后对细胞的毒性浓度是否与体外细胞毒性浓度一致，有些中药体外活性可能与临床疗效不一致，尚不清楚。因此仍需进行药理及临床试验等深入研究工作。本细胞毒性试验，可确定药物对细胞的最大安全浓度，评价药物毒性，为以后临床用药提供一定参考。

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