发酵床养猪模式中猪肠道与垫料间的菌群相关性分析

周学利，吴锐锐，李小金，方国跃

（1.安徽省农业科学院 畜牧兽医研究所，安徽 合肥230031；2.安徽省种畜禽质量测定站，安徽 滁州239083）

发酵床养猪模拟原始的动物、植物和微生物共生的生态系统，在猪舍内铺设一定厚度的谷壳、锯末和秸秆等富含纤维的植物，混以“发酵床专用益生菌”，猪排出的粪尿在垫料中经微生物发酵降解、消化，从而达到猪舍免冲洗、粪尿无排出、限药无公害的节约、保暖、环保和健康等目的［1-4］。我国自起源国引入该项技术［5-6］，相继在江苏、福建、山东等地研究推广并取得了较好的成果［7］。

发酵床养猪符合猪的生活习性，是目前饲养管理难度最高、养殖技术最先进、圈舍造价最低廉，以及健康、环保理念最科学的一种生态养猪模式。一些猪场由于在认知、垫料配制、管理技术、设施和责任心等方面的不足，往往难以真正掌握发酵床养猪技术，出现许多“死床”或者“准死床”，霉菌、寄生虫及致病菌容易在垫料中增殖［8-11］。

因此，在不考虑环保成本的前提下，发酵床养猪模式在国内越来越受到试用者多方面的质疑。持反对观点的人尤其担心垫料中的有害微生物会打破猪肠道内的微生态平衡体系，从而引发疾病。针对环境中细菌的致病性这一焦点问题，郑雪芳等发现发酵床垫料对各种大肠杆菌的生防效果随发酵床使用时间的延长而增加［12］；伍清林等的研究结果显示，动物园各种健康动物的生活环境（空气、土壤和水）中均广泛存在致病菌与非致病菌［13］，而且同种细菌在不同种动物的环境中含量存在差异［14］，表明不同动物与其环境中的细菌之间存在抑制性和适应性。

为了进一步了解发酵床垫料与猪肠道中各种细菌的分布，以及垫料与猪肠道之间的细菌是否存在相关性，我们采集了某发酵床养殖场不同日龄猪只的肠道内容物以及不同饲养阶段的发酵床垫料，分析了所采样品中的细菌种类和数量，检测了分离菌株的致病性和致病菌株的耐药性，以期为发酵床养殖模式的疫病防控提供依据 。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用20 g昆明小鼠，购自安徽医科大学动物实验中心。胰蛋白胨大豆琼脂平板（TSA）、胰蛋白胨大豆培养基（TSB）、血平板、麦康凯平板、生理盐水、PBS缓冲液（p H 7.2），参照文献［15］由实验室自制。微量生化反应管、革兰氏染液，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 样品采集与保存

无菌采集某发酵床养猪场健康乳猪、保育猪和肥育猪新鲜的肠道内容物各15份，以及相应产房、保育舍、肥育舍的发酵床床面下30 cm处垫料各15份，置4℃冰箱保存。

1.3 垫料与肠容物的细菌分离

将每份样品取0.5 g分别置于灭菌离心管内，向离心管内各加入1 m L生理盐水，混合均匀，用接种环蘸取每个样品浸出液划线接种于2个TSA平板，分别置37℃厌氧、需氧培养18～36 h，对不同形态的菌落进行染色、镜检，用TSA平板纯化细菌，以血平板或麦康凯平板等进行鉴别培养。

1.4 分离菌生化鉴定

根据《伯杰氏细菌鉴定书册》，用细菌微量生化反应管鉴定分离到的不同细菌。

1.5 垫料与肠容物的细菌计数

随机选取1.3制备的每种猪龄肠容物浸出液3个、每种猪舍垫料浸出液3个，用生理盐水倍比稀释，每个稀释度涂布2块TSA平板，每板100μL稀释液，分别置37℃ 厌氧、需氧培养18～36 h，根据菌落形态和细菌形态分别进行活菌计数，分析样品中的细菌浓度。

1.6 分离菌株致病性试验

将发酵床垫料中分离纯化的不同菌株分别接种于5 m L TSB培养基，37℃摇床培养8～12 h，分别取10μL培养液接种于15 m L TSB培养基继续培养8～12 h后，取10 m L培养液于灭菌试管内4 000 r／min离心5 min，用灭菌PBS液重悬。倍比稀释菌悬液，采用平板涂布法进行活菌计数；用PBS液将菌悬液稀释成1×108CFU／m L，取0.5 m L稀释液腹腔注射小鼠，每种菌株注射1只，5只对照组小鼠每只腹腔注射无菌PBS液0.5 m L。记录小鼠的发病情况，及时从死亡小鼠的肝脏分离鉴定病原菌。

1.7 主要病原菌耐药性检测

用药敏纸片法检测1.6确定的致病菌的耐药性，分析致病菌的耐药谱和敏感药物。

2 结果与分析

2.1 分离菌生化鉴定

主要分离到6种细菌，生化试验结果见表1。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》分别鉴定为大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黏液性枯草芽孢杆菌。

表1 分离菌生化鉴定结果Table 1 Biochemical identification results of isolates

2.2 垫料与肠容物细菌分离结果

厌氧培养和需氧培养得到的细菌基本相同。各试验样品中分离到的细菌，种类相同，但同种细菌在不同样品中的含量存在差异。分离到的细菌种类主要为大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌、普通枯草芽孢杆菌和黏液性枯草芽孢杆菌（见表2）。

表2 猪肠容物和垫料的细菌分离株数Table 2 The number of bacteria isolated from intestinal contents and pad material

在不同年龄猪肠容物中，大肠杆菌的分离率为100%，粪链球菌的分离率为84.4%，这两种细菌都是肠道内的正常微生物，致病力不强，其数量虽然较多但一般都会维持在正常的范围内。尽管葡萄球菌的分离率在53.3%以上，但金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的分离率较低，这两种细菌虽然毒力较强，但在健康动物肠道内常维持低浓度水平，只有在肠道内的微生态平衡遭到破坏时，才会过度繁殖而致病。

在发酵床垫料中，大肠杆菌的分离率为100%，这可能是由于粪便直接排放到垫料中的缘故；空气中常见的葡萄球菌在保育猪肠容物、保育舍垫料以及肥育舍垫料中的分离率均高达100%；垫料中链球菌的分离率，产仔舍为46.7%，保育舍为66.7%，肥育舍为33.3%，均低于肠容物中的分离率。环境中普遍存在的枯草芽孢杆菌在垫料中的分离率高达97.8%；黏液性枯草芽孢杆菌是发酵床垫料中的主要益生菌，其在产房和保育舍垫料中的分离率均为100%，在肥育舍垫料的分离率降为80%（这可能与肥育期发酵床管理难度加大，发酵效率下降有关），但该菌很难从猪的肠容物中分离到。

2.3 分离菌株的小鼠致病性试验

小鼠致病性试验结果显示：大肠杆菌各分离株均能100%致死小白鼠，但菌株的毒力存在差异，同样注射0.5 m L菌悬液，少数菌株在接种后6～10 h致死小鼠，多数菌株在12～14 h致死小鼠。死亡小鼠的肝脏中均可分离出大肠杆菌。分离到的16株沙门氏菌均能在接种后12～18 h 100%致死小鼠，死亡小鼠的肝脏中均可分离出沙门氏菌。分离到的各链球菌，接种小鼠36 h后，小鼠均存活，但可以从存活小鼠的肝脏中分离到链球菌，表明小白鼠不是链球菌致病性试验的模型动物。小鼠在接种金黄色葡萄球菌后16～24 h可100%死亡；分离到的灰白色葡萄球菌，少数菌株的毒力较强可致死小鼠，多数菌株的毒力较弱，仅使小鼠在接种后出现沉郁。分离到的枯草芽孢杆菌和黏液性枯草芽孢杆菌，分别是环境中的常在菌和添加到垫料中的益生菌，均无致病性，注射小鼠36 h后小鼠均无异常表现，存活小鼠的肝脏中不能分离到接种菌。

2.4 病原菌的耐药性检测

用药敏纸片法检测分离菌株中致病菌对18种常用药物的耐药性，结果见表3。表3表明，大肠杆菌仅对头孢曲松钠、头孢噻肟和丁胺卡那霉素高度敏感，对其它药物均不敏感；沙门氏菌仅对头孢曲松钠、头孢噻肟和丁胺卡那霉素高度敏感，对先锋霉素Ⅵ、左氧氟沙星和恩诺沙星中度敏感，对其它试验药物均不敏感，其耐药谱较广；金黄色葡萄球菌仅对头孢噻肟高度敏感，对头孢曲松钠和红霉素中度敏感，对其它试验药物均不敏感，其对试验药物的敏感率仅为5.6%，耐药谱十分广泛；猪链球菌仅对先锋霉素Ⅵ和新霉素高度敏感，对庆大霉素中度敏感，对其它试验药物均不敏感。

3 讨 论

3.1 细菌的广泛存在性揭示疫病防控的关键环节

本试验中分离到的大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌和普通枯草芽孢杆菌为致病菌或非致病菌，它们广泛存在于发酵床垫料中和猪肠道内，但猪群并不发病。这与伍清林等［13］报道的动物园各健康动物的环境（空气、土壤和水）中广泛存在多种致病菌及非致病菌的研究结果相一致。表明在动物细菌性传染病的三个防控环节中，关键的环节既不是“控制传染源”，也不是“切断传播途径”，而是“保护易感动物”，改善其生存环境，提高动物体质，维持动物体内的和环境中的致病菌与非致病菌间的微生态平衡。

3.2 细菌对环境的适应性和环境对细菌的选择性

伍清林等的研究［14］显示，同一动物园内不同品种动物的生活环境中，生存的细菌种类相似但同种细菌在数量上存在较大差异，表明环境对细菌的生长具有抑制性和选择性，同时也表明细菌对环境具有一定的适应性。该研究与本试验的结果相一致。

表3 病原菌的耐药性检测结果Table 3 Test results of antimicrobial resistance of pathogenic bacteria

本试验中，不同年龄猪的肠道内容物以及不同圈舍的发酵床垫料分离到的细菌种类相同，这表明在发酵床养猪的过程中，垫料中的细菌来自空气、植物碎屑和猪肠道内容物，猪肠道内容物中的细菌主要来自垫料、饲料和细菌的早期定植，空气中的细菌主要来自垫料和猪肠道。垫料、猪肠道和空气三者之间，除了普遍存在葡萄球菌、大肠杆菌这两种细菌之外，其它细菌的数量差异较大，三者之间的细菌数量均不成正相关。垫料中链球菌的数量低于猪肠道，大肠杆菌的数量略低于猪肠道；而垫料中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黏液性枯草芽孢杆菌在数量上则显著高于猪肠道。猪肠容物和垫料中的细菌（包括有益菌和有害菌），在种类上基本相同，但在构成比例上不同，表明垫料中各种细菌的数量比例不能影响肠道中各种菌群的数量比例。同一种细菌（例如链球菌或沙门氏菌）在不同年龄猪的肠道内数量不等，表明肠道（环境）能根据不同日龄猪消化吸收的需要，来选择性调整和控制肠道内一种或多种细菌的数量；不同种细菌在肠道内的数量不尽相同，也表明环境对定植的细菌具有选择性；一种细菌并非能在猪肠道或垫料中肆意生长，会有其它细菌和目前尚不明确的因素有效地控制各种细菌的浓度，保持健康、合适的微生态平衡，直至环境发生较大的改变。尽管垫料中某种细菌的数量较多，但并不能提高该种细菌在肠道内的浓度与数量，表明肠道中各种细菌的数量及其比例不受外界环境中细菌数量或种类的影响。链球菌在猪肠道中的分离率显著高于垫料，表明细菌对环境具有适应性和选择性，肠道中的主要致病菌并非都能在垫料中很好地适应、生存和大量繁殖；反之亦然，垫料中的有害微生物即使浓度很高，但其在猪肠道中的含量不一定也高，表明垫料中的细菌不一定都适于在猪肠道中生存和造成危害。

3.3 猪肠道中有害菌对猪群健康的影响

肠道内分离到的致病性细菌都是肠道内的正常微生物，其与肠道内的其它微生物共同维系机体的正常生理机能和肠道内的微生态平衡。实践表明，有不少发酵床养殖场的猪群发病率极低，说明垫料和肠道中的致病菌并不能使猪发病。如大肠杆菌是最常见的细菌，也是常见的病原菌，但却是猪肠道内的正常微生物之一。尽管垫料和猪肠道中大量存在大肠杆菌，但猪群一般并不发病。

3.4 发酵床养猪对病原菌耐药性的影响

分离菌株的耐药性检测结果表明，猪群自身携带（肠道内）的致病菌和环境中的致病菌，其耐药性均较强，这也反映出细菌耐药性增强的普遍性。发酵床养猪是近年才兴起的一种节水、环保的养猪新技术，该技术还未被广泛接受和应用；而且该技术要求限制使用抗生素。因此，发酵床养猪场中细菌耐药性的产生，应当归咎于传统的规模化养猪模式中药物的持续使用、过量使用和其它方式的不规范使用。传统养殖模式过度依赖抗生素，随着细菌耐药性的普遍增强，传统养殖模式在疾病防控方面将受到越来越严重的制约。既然抗生素对耐药的细菌收效甚微，用药与不用药的差别不明显，因此在疾病防控方面就不必担心发酵床养猪过程中对抗生素的限用。限用抗生素，会降低细菌的耐药性，减少猪肉中的药物残留。发酵床养猪是有效克服细菌耐药性的健康养殖模式，猪场细菌的耐药性也有望就此得到逐步改观。

3.5 发酵床管理对猪群健康的影响

发酵床养殖模式设计的垫料厚度及垫料成分，非常适宜益生菌的繁殖，益生菌成为优势菌群，并能发酵垫料中的猪粪污，其发酵产生的高温可以抑制其它细菌（包括致病菌）及寄生虫的繁殖，促使猪在发酵床上健康成长［2，16］。正常的发酵床垫料可以抑制大肠杆菌特别是携带毒素基因的大肠杆菌的生长，且对大肠杆菌的生防效果随发酵床使用时间的延长而增加［12］。在发酵床养殖的过程中，饲养员如果没有掌握相应技术，或者责任心不强，就会造成发酵床的湿度不当、发酵不充分和温度偏低，导致发酵床对猪不再舒适，益生菌被抑制，致病菌大量繁殖。只要管理不当，发酵床就不再是猪生活的良好环境，猪的抗病力必然下降，发酵床中的病原菌也会大量滋生，此时即便补充益生菌也收效甚微，猪群会因病原菌的大量侵入而发病。因此发酵床养殖过程中的饲养管理与环境控制至关重要［17］。

3.6 本研究尚待解决的问题

本研究比较了发酵床模式中垫料和猪肠容物间菌群的相关性，有待进一步比较同一个养猪场内，发酵床模式与传统饲养模式下相同日龄猪舍的猪肠容物、垫料和水泥地面或漏缝板的细菌分布情况。本试验表明，尽管发酵床垫料与猪肠容物内的致病性细菌含量高，但猪群并不仅仅因为感染了大量致病菌和生活在致病菌的环境中就发病；尚须研究因发酵床管理不当导致发病的猪舍中垫料与猪肠容物内的细菌分布情况。

4 小 结

发酵床垫料和猪肠容物中含有的细菌种类基本相同，但含量差异较大，表明细菌与环境之间具有双向的适应性和选择性。发酵床猪舍垫料和猪体内含有一定量的致病菌，有潜在发病威胁。发酵床是目前节水、环保的养猪模式，对技术及饲养员责任心要求高，特别是在高温高湿的地区或季节。

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