海带多糖和枸杞多糖对山羊精液冷冻保存效果的影响

李方舟，王艳华，温　飞，杜烨青，张利坤，陈美杰，白秦生，朱海鲸，胡建宏*

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.拉萨市动物疫病预防控制中心，西藏 拉萨 850000；3.陕西省秦胜牧业有限责任公司，陕西 扶风 722206；4.榆林学院 陕北白绒山羊工程技术研究中心，陕西 榆林 719000)

国内外对羊肉与羊绒等产品的需求与日俱增，提高养羊业的生产效率，实现山羊品种的扩繁迫在眉睫，而精液保存技术正是加强山羊良种扩繁的关键。山羊冷冻精液保存技术作为精液保存技术的一种，能实现精液远距离运输，延长精子使用时间，提高种公羊的利用率，降低生产成本，有效推进山羊品种改良工作。精液冷冻过程中温度的变化会对精子造成冷冻损伤，严重影响精子质量。大量研究表明，在精液冷冻稀释液中加入保护剂可提高冷冻保存后精子质量[1-4]。近年来，多糖作为冷冻保护剂开始受到研究者的关注[5-7]。海带多糖(LJP)是从海带中提取出来的一种物质，具有抗氧化、降低血压、降低血脂、抑制肿瘤生长等功能。陈西英[8]在绵羊冷冻稀释液中加入了海带多糖，结果表明海带多糖可以有效提高绵羊冻精保存的精子活率，其中最适浓度为1.0 mg/mL。Hu等[3]发现海带多糖不仅能够有效改善冻融后的猪精子活率，同时也显著增加了精浆中三种抗氧化酶(SOD、 CAT、GSH-Px)的活性。枸杞多糖(LBP)是传统中药的提取物，也具有抗氧化、降血脂、降血压、抗肿瘤等多种生物活性。何涛[9]在猪精液冷冻稀释液中加入枸杞多糖，结果表明添加浓度为0.75 mg/mL的枸杞多糖后，精液品质得到了显著提高。

本试验在山羊冷冻精液稀释液中分别加入不同浓度海带多糖和枸杞多糖，研究两种物质对精子活率、质膜完整率、顶体完整率、线粒体活性的影响，另外联合添加海带多糖与枸杞多糖，探讨两者有无协同作用，以便进一步提高山羊冷冻精液的品质。

1　材料与方法

1.1　主要试剂与仪器

柠檬酸、果糖、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、罗丹明123(R-8004，Sigma)、二甲基亚砜(Amresco 0231)、异硫氰酸酯荧光素标记的花生凝集素、碘化丙啶(P4170，Sigma)、硫酸链霉素(华北制药股份有限公司)、霉素钠、海带多糖与枸杞多糖均由Solarbio公司提供。 倒置荧光显微镜(NIKON，日本)、程序降温仪(Cryologic，澳大利亚)、高速台式离心机、电子恒温水浴锅、电子分析天平、压力蒸汽灭菌器、恒温干燥箱、移液枪(Eppendorf，德国)。

1.2　试验设计

分别添加不同浓度的海带多糖与枸杞多糖于冷冻基础稀释液中，冻融后检测精子品质，找到最适宜的添加浓度；根据前两个试验的最适宜添加浓度，联合添加海带多糖、枸杞多糖(表1)，最后检测山羊精液冷冻保存的效果。其中每个处理组重复数为3个。

1.3　冷冻稀释液配制

基础稀释液：柠檬酸1.825 g ，Tris 3.634 g，果糖0.504 g，加到100 mL超纯水中，混匀，于4 ℃保存。抗氧化剂添加：分别将不同浓度的海带多糖、枸杞多糖、海带多糖与枸杞多糖的配伍添加到基础稀释液中(表1)。冷冻稀释I液：向基础稀释液中添加0.4 g/mL链霉素和2 000 IU/mL青霉素，然后加入达到稀释液总量15%的卵黄。冷冻稀释II液：在稀释I液中直接加入5%的甘油。

表1　山羊精液冷冻稀释液中不同抗氧化剂浓度Table 1　The concentration of different antioxidant in cryopreservation extenders of goat sperm

1.4　其它溶液配制

低渗液：称取果糖0.9 g和柠檬酸钠0.49 g，溶于100 mL双蒸水中。FITC-PNA染液：取PBS溶液100 mL，加入FITC-PNA 0.000 1 g，溶解；过滤(0.45 μm滤膜)；-20 ℃保存。碘化丙啶(PI)贮存液配制：取PBS溶液10 mL，加入PI 0.000 2 g，溶解；过滤(0.45 μm滤膜)，-20 ℃保存。罗丹明 123(Rh123)贮存液配制：取0.000 2 g罗丹明123，加入 到1 mL二甲基亚砜 (DMSO)溶液中，溶解，过滤(0.45 μm滤膜)，常温保存。

1.5　精液处理

1.5.1精液的采集与处理试验所用精液来源于5只年龄3～4岁的陕北白绒山羊。用假阴道法采集精液，将精子活力为0.8以上的精液保存于38～40 ℃保温杯中，1 h内带回实验室。

1.5.2精液的第一次稀释与平衡按照精液、稀释液1：2的比例，用冷冻稀释I液稀释精液，16层纱布包严，4 ℃ 温度下降温平衡2 h。

1.5.3精液的第二次稀释与平衡将第一次稀释平衡后的精液与冷冻稀释II液，按照1:2比例再次稀释，16层纱布包裹后置于4 ℃温度下平衡1.5 h。

1.5.4精液的冷冻与解冻4 ℃下将精液分装于0.25 mL细管，放入程序冷冻仪，速率调至1 ℃/min ，降温为5 ℃～-5 ℃。当恒温至-5 ℃时，将细管取出放于液氮上方3～5 cm处5 ～7 min，然后再迅速投入液氮中冷冻。两周后取出，在38 ℃温度下解冻30 s。

1.6　检测指标

1.6.1精子活率精液解冻后，取样10 μL，制片后置于配备37 ℃ 恒温台的光学显微镜(400×)下观察，按照估测法进行精子活率判定。每个样本观察三个视野。

1.6.2精子顶体完整率移液枪吸取精液30 μL于载玻片上制片，自然干燥后，用甲醇固定10～15 min，然后用10 μL FITC-PNA 染色，37 ℃避光潮湿环境保存，30 min后用PBS冲洗，待自然干燥后封片，放置在荧光显微镜下观察。异硫氰酸酯荧光素标记的花生凝集素(FITC-PNA)染色的方法[11]检测顶体完整率。

1.6.3精子质膜完整率吸取20 μL精液，与等温低渗溶液(HOST)200 μL混匀，置于37 ℃环境1 h，在400×显微镜下观察，观察精子弯尾率。采用低渗肿胀(HOST)[12]试验方法测定精子质膜完整率。

1.6.4精子线粒体活性先将精液用精液稀释I液稀释，然后吸取50 μL，再加入PI和Rh123混合液(PI贮存液1 μL+Rh123贮存液1 μL，避光放置10 min后形成)，混匀，放置30 min，最后每组取10 μL样品滴于载玻片上，显微镜下(400×)观察，计算线粒体活性。

1.7　统计分析

用 Excel 2013对试验数据进行初步整理，用SPSS 22.0对结果进行方差分析，用Duncan法进行均值的多重比较，结果用“平均数±标准差”表示。

2　结果与分析

2.1　海带多糖对山羊精液冷冻保存效果的影响

由表2可知，相较于对照组，在冷冻基础稀释液中添加不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL)的海带多糖均能提高解冻后精子活率、顶体完整率、质膜完整率及线粒体活性。当添加浓度为1.0 mg/mL海带多糖时效果最佳，其精子活率、顶体完整率、质膜完整率及线粒体活性均显著高于其余各组(P<0.05)。此外，添加浓度为4.0 mg/mL海带多糖时效果相对较差，其精子活率、顶体完整率、质膜完整率及线粒体活性和对照组相似(P>0.05)。

表2　海带多糖对山羊精液冷冻效果的影响Table 2　Effect of Laminaria Japonica Polysaccharide on cryopreserved goat semen

注：同列数据上标小写字母不同代表差异显著(P<0.05)，相同表示差异不显著(P>0.05)。下同。

Note：Values with different lowercase superscripts in the same column mean significant difference (P<0.05),same letters mean insignificant difference (P>0.05). The same below.

2.2　枸杞多糖对山羊精液冷冻保存效果的影响

由表3可知，在基础稀释液中加入不同浓度的枸杞多糖均能提高山羊精液质量(精子活率、顶体完整率、质膜完整率及线粒体活性)。其中，添加浓度为4.0 mg/mL和6.0 mg/mL的枸杞多糖能显著提高山羊精子冷冻保存效果(P<0.05)，以添加浓度为4.0 mg/mL的枸杞多糖效果最佳。当添加高浓度的枸杞多糖(8.0 mg/mL)时，除精子活率外，精子的顶体完整率、质膜完整率及线粒体活性均与对照组差异不显著(P>0.05)。

表3　枸杞多糖对山羊精液冷冻效果的影响Table 3　Effect of Lycium Barbarum Polysaccharide on cryopreserved goat semen

2.3　联合添加海带多糖和枸杞多糖对山羊精液冷冻保存效果的影响

由表4可知，与对照组相比，联合添加海带多糖与枸杞多糖浓度为0.5 mg/mL+4.0 mg/mL时对于精子活率与顶体完整率的改善效果最好(P<0.05)；与对照组相比，联合添加海带多糖+枸杞多糖为1.0 mg/mL+2.0 mg/mL时对于精子质膜完整率的改善效果最好(P<0.05)；联合添加海带多糖+枸杞多糖浓度分别为0.5 mg/mL+4.0 mg/mL和1.0 mg/mL+2.0 mg/mL的结果与单独添加海带多糖最适浓度组和单独添加枸杞多糖最适浓度组的精液质量(精子活率、顶体完整率、质膜完整率以及线粒体活性)差异均不显著(P>0.05)；所有联合添加组与单独添加组之间以及各自组间的精子线粒体活性均无显著性差异(P>0.05)。

表4　联合添加海带多糖和枸杞多糖对山羊精液冷冻效果的影响Table 4　Combined effect of Laminaria Japonica Polysaccharide and Lycium Barbarum Polysaccharide

3　讨　论

在精液冷冻保存过程中，温度的变化是造成精子损伤的主要因素，因此需要加入冷冻保护剂以提高精液冻存后的品质。本试验将海带多糖作为非渗透性冷冻保护剂以研究其对精液品质影响，结果表明，一定浓度海带多糖可提高山羊精液冷冻保存质量，以添加浓度为1.0 mg/mL的海带多糖效果最佳。何涛等[12]发现在猪精液冷冻稀释液中添加浓度为1.0～1.5 mg/mL海带多糖可提高猪精液冷冻质量。陈西英[8]发现，稀释液中添加1.0 mg/mL的海带多糖能够提高抗氧化酶SOD活性，抑制ROS的发生，绵羊冻融后的精子质量。上述研究与本试验结果基本一致，这可能跟海带多糖的物理和化学特质相关。海带多糖由于分子量过大，不能穿过细胞膜，使细胞膜内外的渗透压不同，会使精子适度脱水。另外海带多糖一定的黏稠性，可包围于精子周围而使精子内冰晶数量减少，达到保护精子提高精液品质的效果[13]。

本试验中，添加4.0 mg/mL枸杞多糖可以显著提高山羊精液冻融后的品质，其冻融后的精子活率、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性等各项指标较对照组均有明显提高。黄宗轩等[14]发现枸杞多糖能提高精子质量和数量；刘心昕等[15]发现枸杞多糖能改善患有少精症的大鼠的精子再生能力。何涛等[12]在猪的精液冷冻稀释液中添加枸杞多糖，发现添加浓度为0.75 mg/mL效果最佳。枸杞多糖对冻精的保护机制，可能与海带多糖类似：一是枸杞多糖所含的多种糖类可清除羟自由基，从而减少MDA产生的可能以及细胞膜流动性的下降[16]；二是可能与海带多糖一样，通过造成细胞内外渗透压差异而使精子细胞脱水，减少胞内冰晶的形成，从而起到保护精子的作用[17-19]；三是类似于海带多糖的物理黏性，使精子细胞外围形成小环境，减少因冰晶形成而造成的精子细胞损伤。Fuller等[20]认为精子结构完整程度跟精子质膜的完整性相关性很高。一般情况下，在冷冻精液冷冻降温过程中，精子内外渗透压的压差，会使精子发生脱水收缩现象，导致精子质量下降。而枸杞多糖因含糖羟基能够一定程度避免高渗环境的出现，从而维持精子细胞膜的稳定[21]。本试验中，6.0 mg/mL组和8.0 mg/mL组虽也能一定程度上提高精液冷冻保存效果，但以4.0 mg/mL添加量效果最好，笔者分析可能是过于黏稠的枸杞多糖能够阻碍精子细胞代谢所致。

本试验发现，精液冷冻保存过程中，适量添加海带多糖或者枸杞多糖都能提高精液冷冻保存品质，这表明海带多糖和枸杞多糖均可对冻精起到保护作用。有不少研究表明，多种类型糖的配合使用对精液冷冻的效果比单一类型的糖效果好[22-23]。潘红梅等[24]研究发现，在猪精子冷冻保存中，乳糖、蔗糖和海藻糖等不同类型双糖的组合的精子质量保存效果优于单一类型的糖。本试验也表明，在山羊精液冷冻保存过程中，添加海带多糖和枸杞多糖的双糖组合的冷冻保存效果同样优于单独添加海带多糖或枸杞多糖，这与前人的研究结果基本一致。其中联合添加海带多糖和枸杞多糖浓度为1.0 mg/mL+2.0 mg/mL以及0.5 mg/mL+4.0 mg/mL时效果更佳，这也暗示海带多糖与枸杞多糖两种多糖在精子冷冻保存即减少精子冷冻氧化损伤方面可能存在一定协同效应。而浓度为1.0mg/mL+4.0 mg/mL的海带多糖与枸杞多糖的组合时，保存效果与单独添加时无显著差异，这可能由于高浓度的多糖物理黏性过强，阻碍了精子活动及细胞代谢所致。

4　结　论

本研究结果表明，山羊精液冷冻保存时，在稀释液中添加一定量的海带多糖或者枸杞多糖均能有效提高山羊精液的冷冻保存质量，其中1.0 mg/mL和4.0 mg/mL为其最适添加浓度；联合添加海带多糖与枸杞多糖，山羊精液冷冻保存效果更佳，其较佳浓度组合为1.0 mg/mL+2.0 mg/mL组合和0.5 mg/mL+4.0 mg/mL组合。

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