自毒物质对羟基苯甲酸降解细菌ZH2的分离与应用

肖蓉 邓舒 赵菁 张春芬 聂园军 曹秋芬

摘要：自毒物质是造成植物连作障碍的主要因子，研究旨在筛选能够降解土壤中自毒物质的细菌。采用选择性分离方法从土壤中筛选自毒物质对羟基苯甲酸降解菌；结合形态特征、生理生化特征和16S rRNA测序鉴定菌种；采用紫外分光光度法测定菌株降解对羟基苯甲酸能力，并通过盆栽实验验证解毒效果。结果表明，分离到1株有降解对羟基苯甲酸能力的菌株，编号ZH2，经鉴定为绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）。在纯培养条件下，当对羟基苯甲酸浓度为5 mg/mL时，ZH2能在培养72 h时将其降解97%。盆栽条件下，当基质中对羟基苯甲酸浓度为10 mg/g时，ZH2能有效缓解对羟基苯甲酸对黄瓜的生长抑制作用。该研究从土壤中分离到能够降解对羟基苯甲酸的绿针假单胞菌，具有应用于连作障碍防控的潜在价值。

关键词：对羟基苯甲酸；自毒物质；绿针假单胞菌；连作障碍；降解

中图分类号：S60文献标志码：A论文编号：cjas2020-0115

An Autotoxicity p-Hydroxybenzoic Acid-degrading Strain ZH2： Isolation and Application

Xiao Rong1， Deng Shu1， Zhao Jing2， Zhang Chunfen1，Nie Yuanjun3， Cao Qiufen2（1Pomology Institute， Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， Shanxi， China； 2College of Life Sciences， Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， Shanxi， China； 3College of Economics and Management， Shanxi Agricultural University， Taiyuan 030031， Shanxi， China）

Abstract： Autotoxicity is the main factor causing obstacles to continuous cropping plants. The aim of the study is to screen bacteria from soil which can degrade autotoxicity. A selective screening method was used to screen p-Hydroxybenzoic acid （PHBA） degradation bacterium. Bacterial species were identified by combining the morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequencing results. The ability of the strain to degrade PHBA was determined by ultraviolet spectrophotometry. The effect of detoxification was verified by a pot experiment of cucumber. The results showed that one degradation strain（No. ZH2） was isolated and identified as Pseudomonas chlororaphis. On the condition of pure culture， ZH2 could degrade 97% at 72 h under 5 mg/mL PHBA concentration. In potted conditions， when the concentration of PHBA in the substrate was 10 mg/g， ZH2 could effectively alleviate the growth inhibition of PHBA on cucumber. We report a Pseudomonas chlororaphis strain screened from soil can degrade PHBA， it has the potential value of controlling continuous cropping obstacles.

Keywords： p-Hydroxybenzoic Acid； Autotoxicity； Pseudomonas chlororaphis； Continuous Cropping Obstacle； Degradation

0引言

化感作用（allelopathy）是指植物向環境释放某些化学物质而影响自身或其他植物生长发育的化学生态学现象。一些化感物质能对下茬同种/科植物生长产生抑制作用，因此也被称为自毒物质（autotoxicity）[1-2]。大量研究已经证实，对于大棚常见的蔬菜、瓜果来说，酚酸类物质是占比最大的自毒物质[3-7]，其中对羟基苯甲酸（p-Hydroxybenzoic acid，PHBA）在草莓和黄瓜根系分泌物中占比最大，毒性很强[8-10]。

在自然界中存在多种对酚酸类物质有降解作用的菌株，利用它们来降低农作环境中自毒物质的含量，是一条安全环保的途径。祁国振等[11]从苹果根际土壤中筛选到5株对苹果根际自毒物质焦性没食子酸、邻苯二甲酸、根皮苷以及对羟基苯甲酸有降解能力的菌株；黄园勇等[12]从根际土中分离到29株对苹果根皮苷有降解功能的放线菌；毛宁[13]也获得了2株能够降解土壤中草莓自毒物质对羟基苯甲酸和苯甲酸的放线菌；王晓辉等[14]从秦岭土及西北极端生境中筛选到24株能够降解西瓜自毒物质阿魏酸的放线菌；另外还有能够降解西瓜自毒物质肉桂酸的微小杆菌（Exiguobacterium sp.）、能够降解花生根际自毒物苯甲酸的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）、耐碱纳西杆菌（Naxibacter alkalitolerans）[15-16]。尽管前人们已报道了这么多有降解效果的菌株，但大多数都还处于室内研究状态，而且由于大田环境的复杂性和多样性，每株菌有其自己的最适生长条件，其在实际使用中的修复效果也不同，因此继续筛选自毒物质降解菌仍然十分重要。

本研究从土壤中筛选能够降解自毒物质对羟基苯甲酸的菌株，通过形态学特征、16S rRNA基因序列分析和生理生化特征对其进行鉴定，并对其在纯培养条件下的对羟基苯甲酸降解效率、温室盆栽条件下的毒害缓解效果进行探究，为将该菌株开发成重茬土壤生物修复剂提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

土壤样品采自山西太原阳曲县（38°03′33.58″N，112°40′22.51″E）大棚草莓、黄瓜根际和重庆市忠县某竹林（30°18′5.07″N，108°02′15.61″E）3种生境。供试黄瓜品种名为：‘新四号’，山东泰安华益种业有限公司。

对羟基苯甲酸、硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钙、氯化钠、蛋白胨、酵母粉均为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒：北京Tiangen公司；PCR引物（27F和 1492R）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列为：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。盆栽基质为莘县鲁源育苗基质有限公司市售成品基质。

所用仪器：恒温水浴摇床（HH-2J），金坛市杰瑞尔电器有限公司；光照培养箱（MLR-350），SANYO；扫描电镜（日本电子，JSM-IT300LA）；紫外/可见分光光度计，eppendorf。

培养基：无机盐基础培养基：硫酸铵2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，氯化钙0.1 g/L，pH 7.2。在无机盐基础培养基中添加3 mg/mL对羟基苯甲酸即为选择性培养基；LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.2[17]。试验于2017—2019年在山西农业大学果树研究所和山西农业大学生命科学学院（龙城校区）进行。

1.2方法

1.2.1对羟基苯甲酸降解菌的选择性分离称取5 g新鲜土样，置于50 mL液体选择性培养基中，于30℃，180 r/min条件下恒温摇床振荡培养。一周后取1 mL培养液用无菌水梯度稀释，分别取10-6、10-7、10-8浓度的稀释液0.2 mL均匀涂布在固体选择性培养基上，30℃，黑暗条件倒置培养。7天后，挑取较大的菌落，在新的固体选择性培养基平板上划线培养，以获得纯菌株。纯菌株保存在LB固体培养基上，供后续实验使用。

1.2.2菌株鉴定参考《常见细菌系统鉴定手册》[18]方法进行生理生化鉴定。菌株的分子鉴定参考[19]。将菌株的16S rRNA序列同时提交至NCBI和EzBiocloud[20]中进行比对，采用MEGA10.1软件对菌株序列及相关标准菌株序列构建系统发育树（最大简约法，bootstrap值：1000）。按谢家仪[21]所述方法制备样品，在扫描电镜下观察菌株形态。

1.2.3菌株的对羟基苯甲酸耐受能力及降解能力用1.1中无机盐基础培养液配制对羟基苯甲酸标准液，浓度分别为：0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.01 mg/mL，在波長255 nm下测定吸光度，绘制标准曲线。取新鲜过夜培养的菌液，于4℃，5000 r/min条件下离心5 min，弃上清，用无菌水将菌体重悬至OD600为1（菌体数目约为2×108cfu/mL），将重悬液按2%的体积比接种到25 mL新鲜的含对羟基苯甲酸无机盐基础培养液中。对羟基苯甲酸浓度分别为0.1 mg/mL、1 mg/mL和5 mg/mL。接种后于30℃，180 r/min恒温摇床中震荡培养。分别于培养4、12、24、36、48、60、72、84、96 h取样。一部分样品用于测定OD600，另一部分样品用于测定PHBA残留量。

将1mL菌液样品加入到无菌离心管中，10000r/min，室温条件离心5 min后，取0.2 mL上清液以不加对羟基苯甲酸的无机盐基础培养液作参比，在波长255 nm下测定吸光度。根据标准曲线计算培养液中的对羟基苯甲酸残留量。按公式（1）计算降解率。Xt指取样时间为t时的PHBA降解率；C0指初始PHBA含量；Ct指取样时间为t时的PHBA含量。

1.2.4菌株缓解对羟基苯甲酸对盆栽黄瓜的毒害先将菌株接种到LB培养基里过夜培养，然后于5000 r/min，4℃条件下离心5 min，收集菌体用无菌水重悬至OD600为1即为拌土用菌液。黄瓜种子于55℃温水中浸种10 min后置于28～30℃培养箱中保湿催芽，然后播种于育苗钵中培养。待幼苗长到两叶一心时选择大小一致的幼苗移栽到10×10×8 cm规格的塑料营养钵中，每钵装灭菌基质40 g，基质按表1进行拌土处理（对羟基苯甲酸先溶解到20 mL水里再均匀拌到基质里）；每盆移栽一株，每处理重复9盆。将营养钵置于光照培养箱（25℃光照18 h，20℃黑暗6 h）。当黄瓜进入初花期后结束实验，每个处理随机选取5棵植株进行各指标的测定。用皮尺测定株高（根基到生长点的长度），游标卡尺测定茎粗（子叶基部下胚轴处的直径），用直尺测定最大叶片的长a（叶片基部到叶尖的长度）和宽b（叶片上部肩宽距离），根据公式（2）计算叶面积[22]。

2结果与分析

2.1对羟基苯甲酸降解菌的选择性分离与鉴定

通过选择性培养基富集培养后从土壤中筛选到1株能以对羟基苯甲酸为唯一碳源生长的细菌，命名为ZH2。该菌株在LB固体培养基上菌落呈圆形，红色，有光泽，表面湿润，不透明，培养24 h时直径1～1.5 mm（图1A、B），培养48 h可见橙色色素，并很快扩散到培养基里（图1C），培养一周后，菌落发粘。在扫描电镜下观察ZH2细胞形态（图1D），发现该菌菌体长约0.3～ 1.0μm，呈杆状，单个生长，一端钝圆，一端稍尖。ZH2部分生理生化特征见表2。

将ZH2菌16S rRNA序列（GenBank Accession No. MT410466）分别输入到EZbiocloud和NCBI数据库中进行序列比对（表3），结果表明，在2个数据库中ZH2都归属于绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis），但在亚种归属上存在分歧。从EZbiocloud中获取相关标准菌株序列构建ZH2的系统发育树（图2），可见ZH2与P. chlororaphis subsp. Aurantiaca和P. chlororaphis subsp. aureofaciens聚在同一个分支上，需结合其他方法确定ZH2的亚种地位。目前，该菌株已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：14461。

2.2菌株的对羟基苯甲酸耐受能力及降解能力

根据不同浓度对羟基苯甲酸标准液对应的吸光度值做出标准曲线，拟合的方程式为：C（A） = 0.0155×A+ 0.0002。R2值为0.9988。

将ZH2培养在以不同浓度对羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基中，其生长曲线和培养基中对羟基苯甲酸降解率见图3。可见，在对羟基苯甲酸浓度很低时（0.1 mg/mL，图3A），刚培养4 h，培养基中的对羟基苯甲酸已经被降解了80%，培养12 h时，对羟基苯甲酸被降解了97%，初始碳源几乎消耗殆尽。从生长曲线来看，OD600值出现增长，但直到培养96 h时，OD值最高仅为0.293，说明由于体系中碳源浓度太低，ZH2并未大规模增殖。

当对羟基苯甲酸浓度增大至1 mg/mL时（图3B），ZH2生长曲线表现出明显的延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。由于碳源相对充足，体系中ZH2在培养12h后出现明显增殖，进入对数生长期，当培养至24 h时，OD值达到1.247，但随后OD值开始下降。从降解曲线来看，体系中对羟基苯甲酸的降解与ZH2菌体的增殖密切相关。培养12 h前，由于菌体未大量增殖，体系中对羟基苯甲酸降解率很低。12 h后随着细菌的大量增殖，对羟基苯甲酸降解率快速增大，24 h后降解率达70%，48 h后降解率达98%。

当对羟基苯甲酸浓度增大至5 mg/mL时（图3C），从生长曲线可以看出，ZH2的生长延缓期明显增长，最大OD值明显增大，稳定期明显缩短，衰亡速度明显增快，说明5 mg/mL对羟基苯甲酸对ZH2有一定的抑制作用，ZH2需要更长时间的适应才能开始正常生长。但适应后，在充足的碳源条件下，ZH2得到充分的增殖（最高OD值达7.92）。但随着初始碳源的降解，中间产物积累，其中一些中间产物可能会对ZH2产生毒害作用，导致ZH2快速进入衰亡期。从降解曲线来看，与图3B一样，体系中对羟基苯甲酸的降解与ZH2菌体的增殖密切相关。培养36 h前，对羟基苯甲酸未被降解；培养48 h时，降解过半；培养72 h时，降解率达97%。

2.3菌株缓解对羟基苯甲酸对盆栽黄瓜的毒害

对羟基苯甲酸和ZH2对黄瓜生长的影响见图4，可见，当基质中含有10 mg/g对羟基苯甲酸时，黄瓜苗的生长受到负面影响，表现为株高、茎粗、真叶数量和最大叶片面积都比对照减小，其中叶面积差异显著。当施加对羟基苯甲酸的同时添加ZH2菌液时，这种负面影响能够减小，甚至生长情况优于对照，表现为株高、茎粗和真叶数量大于对照，但最大叶片面积仍小于对照。说明ZH2菌液不仅能够缓解对羟基苯甲酸对黄瓜苗的毒害作用，而且能够促进黄瓜苗生长。

3讨论与结论

假单胞菌属广泛存在于土壤、水体及植物根际，由于其具有多种功能而被广泛研究[23-25]。该属菌株具有对植株生长的促进作用、对病原微生物的抑制作用以及对有机物的降解作用，是近几十年来生物土壤处理的重点。在耕地资源有限的前提下，植物根际产生的自毒化感物质成为制约农业产业可持续发展的重要障碍，尤其是在重茬栽培系统中，自毒物质的积累严重影响植物的正常生长。假单胞菌属在植物根际自毒物质降解方面表现突出。Guzik等[26]从活性污泥中分离到菌株P. putida N6，能够利用许多种芳香物质，包括对羟基苯甲酸、苯酚、邻苯二酚、香草酸、苯甲酸[26]。Fujisawa等[27]1968年也曾经报道菌株P. aeruginosa能够降解对羟基苯甲酸。Chen等[28]从黄瓜根际土壤中筛选到一株能够降解对羟基苯甲酸的P. putida CSYP1。但据笔者所知，关于绿针假单胞菌降解这类芳香酸的报道很少，只有Waechter-Kristensen等[29]1994年报告从封闭的西红柿水培体系培养液中分离到能够降解对羟基苯甲酸的菌株被鉴定为P. aureofaciens，当体系中浓度为50μmol/L时，72 h内对羟基苯甲酸降解了约40%。本研究分離的ZH2来源于土壤，能够以对羟基苯甲酸为唯一碳源生长，在纯培养条件下具有降解对羟基苯甲酸的功能。当体系中对羟基苯甲酸浓度为5 mg/mL时，72 h降解了约97%。

本研究中根据16S测序及部分生理生化结果显示ZH2在种水平上属于绿针假单胞菌，但在亚种分类上还不够明确。这是由于绿针假单胞菌的3个亚种（P. chlororaphis， P. aureofaciens和P. aurantiaca）之间本来就十分相似，关于它们的分类历史上曾经存在分歧。1989年前，此3株菌被认为是不同的种[30]，后来P. aureofaciens被认为是P.chlororaphis的亚种，而P. aurantiaca仍然认为是不同的种。然而Peix等[31]2007年通过几乎完整的16S rRNA基因分析、DNA-DNA杂交实验、脂肪酸分析和表型性状分析结果表明，尽管3株菌之间有一些差异，但他们之间有密切的亲缘关系，表型和分子数据支持将这3株菌归类为P. chlororaphis的3个亚种。因此，ZH2在亚种水平上的分类还需要借助其他手段来确定。

关于绿针假单胞菌，前人有许多研究，但大多数文献报道均与绿针假单胞菌能产生具有广泛抗真菌活性的吩嗪类物质相关，能够产生吩嗪的绿针假单胞菌能够抑制植物病原微生物，被当作生物防治菌株来防治各种植物病害[32-35]。国内对绿针假单胞菌研究较多，其中最突出的是上海交通大学张雪洪教授课题组。他们从甜椒根际土壤中分离得到一株绿针假单胞菌株GP72，能够产生吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxilic acid， PCA）和2-羟基吩嗪（2-hydroxyphenazine，2-OHPHZ），对辣椒疫霉、西瓜炭疽病、终极腐霉、水稻纹枯病菌、瓜果腐霉等具有好的拮抗作用。该菌株的应用效果得到了国际上的广泛认可，已经申请了专利[36-37]。国外方面的研究也证实绿针假单胞菌能够抑制植物病害，诱导植物的ISR和过敏反应[34-35]，有溶磷功能、能产生铁载体、HCN和激素类物质，能顺利定殖到各种植物根际[23，38]，能促进多种植物的生长并提高产量[39]。本研究主要关注ZH2对自毒物质的降解，还未在ZH2对植物病害的抑制方面做深入的研究。但Peix指出假单胞菌属产生的橙色色素往往反映出吩嗪的产生[31，40]，本研究中，ZH2在LB培养基上培养24 h时即会产生明显的橙色、可以扩散的非荧光色素，推测ZH2也会有广谱抗菌功能，下一步我们将进行ZH2菌株的抗病潜力探索。同时，ZH2菌株降解对羟基苯甲酸的最佳条件及在大田的实际应用还需进行深入的研究。

综上所述，本研究从土壤中筛选到能够降解自毒物质对羟基苯甲酸的绿针假单胞菌ZH2，在纯培养条件下，当对羟基苯甲酸浓度为5 mg/mL时，ZH2能在培养72 h时将其降解97%。盆栽条件下，当基质中对羟基苯甲酸浓度为10 mg/g时，ZH2能有效缓解对羟基苯甲酸对黄瓜的生长抑制作用。ZH2在重茬障碍生物防治中具有潜在的应用价值。

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