腐烂茎线虫对当归细胞结构和生理特性的影响

漆永红 张新瑞 曹素芳 李敏权 李青青 李雪萍 蒋晶晶 李继平

摘要：為了明确当归受到腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）侵染后其根部细胞结构和叶部生理特性的变化，本试验以‘岷归1号和腐烂茎线虫为材料，采用田间自然发病条件测定了腐烂茎线虫侵染后当归根部细胞结构，以及叶部生理特性的变化规律。徒手切片光学显微镜观察结果表明，腐烂茎线虫侵染后，根部发病部位细胞受到严重破坏和断裂。当归病叶片叶绿素含量降低，达到1.18 mg/g，电解质渗漏电导率升高，为76.19 ws/cm。当归病叶的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均降低，胞间CO2浓度升高；当归病叶光饱和点、最大净光合速率、暗呼吸速率和CO2饱和点均降低，而光补偿点和CO2补偿点均升高。同时当归病叶营养元素氮、磷、钾、锌、锰、铁的含量降低，分别为2.41、5.71、36.07、33.53、112.37、1318.03 g/kg，而铜、钙、镁的含量增加，分别达到8.07、538.13、33.13 g/kg。本研究为阐明当归麻口病的发病机制提供了理论依据。

关键词：当归；腐烂茎线虫；细胞结构；光和CO2响应；生理特性；营养元素含量

中图分类号：S432文献标志码：A论文编号：cjas2020-0087

Ditylenchus destructor： Effects on the Cell Structure and the Physiological Characteristics of Angelica sinensis

Qi Yonghong1， Zhang Xinrui1， Cao Sufang2， Li Minquan1， Li Qingqing1， Li Xueping1， Jiang Jingjing1， Li Jiping1

（1Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， Gansu， China；

2Institute of Fruit and Floriculture Research， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， Gansu， China）

Abstract： To determine the changes of root cell structure and leaf physiological characteristics of Angelica sinensis after infected with Ditylenchus destructor，‘Mingui 1and D. destructor were used in this study. The cell structure of roots and the physiological characteristics of leaves were tested in filed by natural diseased condition. Microscopic observation showed that the cell structure of the diseased roots were seriously damaged and broken after infected with D. destructor. The chlorophyll content in diseased leaves decreased to 1.18 mg/g， while the electrolyte leakage conductivity increased to 76.19 ws/cm. The net photosynthetic rate， the stomatal conductance and transpiration rate decreased， whereas the concentration of intercellular CO2 increased. Moreover， compared with the control， the light saturation point， the maximum net photosynthetic rate， the dark respiration rate and the CO2 saturation point decreased， while the light compensation point and the CO2 compensation point increased. The content of nitrogen， phosphorus， potassium and some nutrient elements including Zn， Mn， Fe decreased to 2.41， 5.71， 36.07， 33.53， 112.37 and 1318.03 g/kg， respectively， while the content of Cu， Ca， Mg increased to 8.07， 538.13 and 33.13 g/kg， respectively. The results could provide a theoretical basis for elucidating the pathological mechanism of A. sinensis disease caused by D. destructor.

Keywords： Angelica sinensis； Ditylenchus destructor； Cellular Structure； Light and CO2 Response； Physiological Characteristics； Nutrient Element Content

0引言

当归（Angelica sinensis）为伞形科多年生草本植物，又名岷归、秦归、西当归、川归等，秋末采挖，以干燥的根入药，味甘、辛，微苦，性温，归于心、肝、脾经，具有补血活血、温中止痛、润肠通便的功效[1]。当归在临床上广泛应用，主要用于治疗月经不调、痛经、血虚血瘀诸症，被欧洲人誉为“妇科人参”[2]。2001年中国农学会特产之乡组委会将甘肃岷县命名为“中国当归之乡”，产量约占全国的90%左右。甘肃省当归的主要产区分布在岷县、宕昌县、漳县、渭源县、甘南州等地，近年来年均种植面积5.3万hm2以上。

陈书珍等[3]报道，由线虫引起的为当归麻口病（Ditylenchus destructor），真菌引起的有当归根腐病（Fusarium sp.）、褐斑病（Septoria sp.）、白粉病（Erysiphe heraclei）、灰霉病（Botrytis sp.）、炭疽病（Colletotrichum dematium）、菌核病（Sclerotinia sp.），细菌引起的有当归水烂病（Pseudomonas fluorescens）、细菌性油脉病、细菌性斑点病以及病毒引起的当归病毒病（番茄花叶病毒ToMV）等。然而，由腐烂茎线虫（D. destructor）引起的当归麻口病是当归生产中的主要病害之一，在甘肃省当归主产区普遍发生。王玉娟等[4]报道，田间发病率84.9%，重病地高达100%。漆永红等[5]对当归麻口病的病原线虫种类进行了形态学鉴定和rDNA-ITS序列分析。刘霞霞等[6]研究了腐烂茎线虫在不同土壤深度、不同土壤类型、不同茬口作物根际土壤的种群动态变化规律。因受经济利益限制，生产上很难与其他作物进行轮作，重茬或连作造成土壤线虫密度逐年增加，致使此病日益加剧；另外，当归种苗的频繁调运导致该病的发病面积呈扩大趋势。腐烂茎线虫在当归生长期间侵入，其在适宜的环境条件下迅速繁殖和侵染[7]，严重影响当归的正常生长和发育。当归受到腐烂茎线虫侵染，一般田间发病率在30%以上，严重制约当归的产量增加和品质提升[8]。

近年来，中国就该病害的病原和防治策略等作了研究，但关于当归受腐烂茎线虫侵染后，其根部细胞结构变化及叶片生理特性的变化规律未见报道。因此，本试验在田间自然发病条件下，观察腐烂茎线虫侵染后当归根部细胞组织结构的变化，测定当归叶片叶绿素含量、电解质渗漏电导率、CO2响应和光响应以及叶片营养元素含量的变化规律，旨在从病原线虫和当归互作的角度揭示腐烂茎线虫的致病机制，为进一步阐明当归麻口病的发病机制提供理论依据。

1材料与方法

1.1供试材料

当归品种：‘岷归1号，当地主栽品种，在甘肃省定西市岷县麻子川镇种植。

麻口病病原线虫：腐烂茎线虫（D. destructor），在甘肃省农业科学院植物保护研究所经济作物病害研究室保存。

1.2测定方法

1.2.1腐烂茎线虫侵染当归根部细胞结构观测对前期发病症状观察，根据当归叶片颜色的差异，以深绿色为健康叶片，黄绿交替症状为轻度发病，黄白交替为重度发病。取健康和发病植株根进行徒手切片，选取较薄的切片置于载玻片上，滴加水合氯醛溶液在酒精灯上进行透化，透化完全后，滴加稀甘油，盖上盖玻片，置于BX51光学显微镜（日本奥林巴斯株式会社）观察。

1.2.2光合特性参数测定于2019年6月22日开展试验，当天天气晴朗，平均空气相对湿度50%～80%。当归植株处于旺盛营养生长期，长势良好，叶片绿色。数据测量前对仪器预热，在田间自然光下诱导0.5～1 h。田间测定健株和病株的叶片，采用LI-6400XT便携式光合测定仪（美国LI-COR公司），分別测定平展叶的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和叶片蒸腾速率。每个处理测定5株，分别取平均值。

1.2.3光响应参数测定采用LI-6400XT便携式光合测定仪（美国LI-COR公司），根据LED红蓝光源设13个光合有效辐射，其值分别为1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、100、50、25、0μmol/（m2·s），将CO2注入系统设定值为450μmol/mol。参照叶子飘[9-10]双曲线修正模型，分别模拟计算最大净光合速率、光补偿点、光饱和点和暗呼吸速率参数。每个处理测定5株，分别取平均值。

1.2.4 CO2响应参数测定采用LI-6400XT便携式光合测定仪（美国LI-COR公司），根据LED红蓝光源设12个CO2浓度，分别为1200、1000、800、600、400、300、250、200、150、100、50、25μmol/mol，通过CO2注入系统，光合有效辐射恒定在1000μmol/（m2·s）。按照叶子飘[9-10]双曲线修正模型，分别模拟计算最大净光合速率、CO2补偿点、CO2饱和点和光呼吸速率参数。每个处理测定5株，分别取平均值。

1.2.5叶片电解质渗漏率采用电导率法[11]测定当归叶片电解质渗漏率，取发病和未发病的新鲜当归叶片若干，剪成约1 cm×1 cm的小叶片，混合均匀后，快速称取发病和未发病样品各2份，每份1 g，一份加入蒸馏水50 mL于常温下放置，另一份加入蒸馏水50 mL，称重后置于电炉上煮沸15 min（用保鲜膜封瓶口），冷却后再称重并补充蒸馏水至原重量，将上述处理后样品于室温下浸提1 h（浸提时轻轻摇动，利于电解质外渗），然后将叶片夹出，利用DDS-11A电导率仪（上海雷磁创益仪器仪表有限公司）测定不同处理的电导率。每个处理重复3次，分别取平均值。

1.2.6叶片叶绿素含量测定取发病和健康的当归叶片若干，剪成约1 cm×1 cm的小叶，分别称取0.1 g鲜样浸泡在10 mL 80%丙酮中，避光48 h，期间每8 h摇动1次，直至叶组织完全变白。采用丙酮浸渍法[12]测定叶片叶绿素含量，利用UV-8420紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）分别测定663、645、440 nm的光密度，每处理3次重复，分别计算叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b，见公式（1）、（2）、（3）。

叶绿素a=12.7A663-2.59A645……………………（1）

叶绿素b=22.9A645-4.67A663……………………（2）

叶绿素a+b=20.3A645-8.04A663…………………（3）

1.2.7叶片氮、磷、钾含量及营养元素测定分别称取0.05 g当归病株和健株叶片干样于消煮管中，采用自动定氮仪法[13]（Kjeltec8200半自动定氮仪）、酸溶-钒钼黄比色法[14]（Cary50紫外可见分光光度计）和酸溶-火焰光度法[15]（M410型火焰光度计）分别测定全氮、全磷和全钾含量。采用火焰吸收原子光谱法（iCE3500原子吸收光谱仪）测定营养元素的含量，包括Zn（GB 5009.14—2017）、Mn（GB5009.242—2017）、Cu（GB 5009.13—2017）、Fe（GB5009.90—2017）、Ca（GB 5009.92—2017）和Mg（GB 5009.241—2017）。每个处理重复3次，求其平均值。

1.3数据处理

采用唐启义等[16]的方法和DPS 2002软件进行统计分析和数据处理，通过Duncans新复极差法检验差异显著（P<0.05）和差异不显著（P>0.05）。

2结果与分析

2.1腐烂茎线虫对叶片透光性的影响

健康的当归叶片，颜色较为均一且呈深绿色（图1A）；轻度发病的当归叶片，叶脉绿色部分退去，透光率增大，呈现黄绿交替的症状（图1B）。重度发病的当归叶片，叶脉绿色全部退去，透光率增强，呈现黄白交替的症状（图1C）。

2.2麻口病对当归根部细胞结构的影响

健康当归根部纵切图，细胞结构规则，木栓层为数列细胞，栓内层窄，有少数油室；韧皮部宽广，多裂隙，油室和油管类圆形，外侧较大，向内渐小，周围分泌细胞6～9个，形成层成环；木质部射线宽3～5列细胞，导管单个散在或2～3个相聚，呈放射状排列；薄壁细胞含淀粉粒（图2A）。轻度发病当归根部，病变部位多存在于木栓层及韧皮部，病变部位细胞形态无明显区别，细胞颜色比正常细胞较深，多呈黄色或黄褐色（图2B）；重度发病当归根部，细胞结构破坏严重，无法观察细胞形态，在显微下呈黑褐色（图2C）。

2.3腐烂茎线虫对当归叶片光合参数的影响

岷归1号病叶净光合速率6.05μmol/（m2·s）、气孔导度0.04 mol/（m2·s）和蒸腾速率2.52 mmol/（m2·s），三者均降低，不同处理间差异显著（表1）；而‘岷归1号病叶胞间CO2浓度270.90μmol/mol高于‘岷归1号健叶212.25μmol/mol，两者差异显著（P<0.05）。

2.4腐烂茎线虫对当归叶片光响应模拟参数的影响

‘岷归1号病叶最大净光合速率17.24μmol/（m2·s）、光饱和点786.22μmol/（m2·s）和暗呼吸速率-6.46μmol/（m2·s），三者均降低，而光补偿点53.11μmol/（m2·s）升高（表2）。‘岷归1号病叶和‘岷归1号健叶之间除最大净光合速率差异不显著外，光饱和点、暗呼吸速率和光补偿点3个参数差异显著（P<0.05）。

2.5腐烂茎线虫对当归叶片CO2响应模拟参数的影响

‘岷归1号病叶最大净光合速率24.05μmol/（m2·s）和CO2饱和点725.20μmol/（m2·s）均降低，而CO2补偿点76.02μmol/（m2·s）和光呼吸速率11.62μmol/（m2·s）升高，各处理间差异显著（P<0.05）（表3）。

2.6腐烂茎线虫对当归叶片电解质渗漏电导率的影响

‘岷归1号病叶电解质渗漏电导率为76.19 ws/cm，而健叶电解质渗漏电导率为54.48 ws/cm，两者差异显著（P<0.05）（图3），结果表明，当归发生麻口病后叶片电解质渗漏电导率升高。

2.7腐烂茎线虫对当归叶片叶绿素含量的影响

岷归1号病叶片叶绿素含量为1.18 mg/g，而健叶片叶绿素含量为1.71 mg/g，两者差异显著（P<0.05）（图4），结果表明，当归发生麻口病后叶片叶绿素含量降低。

2.8腐烂茎线虫对当归叶片营养元素含量的影响

发病当归叶片N、P、K、Zn、Mn、Fe的含量降低，分别为2.41、5.71、36.07、33.53、112.37、1318.03 g/kg，而Cu、Ca、Mg的含量增加，分别达到8.07、538.13和33.13 g/kg（表4）。发病当归叶片和健康当归之间N、Zn、Mn、Fe、Ca、Mg、Cu的含量差异显著（P<0.05），而P、K的含量差异不显著。

3讨论与结论

由腐烂茎线虫引起的当归麻口病是当归生产区普遍发生的主要病害之一，目前，关于麻口病的研究主要集中在病害发生情况调查、病原种类鉴定、发生发展规律和田间防治技术上[17-19]，有关当归受腐烂茎线虫侵染后，其根部细胞结构变化及叶片生理特性的变化规律未见深入研究。本试验首次在田间自然发病条件下，明确了腐烂茎线虫侵染后当归根部细胞组织结构的变化，测定了当归叶片叶绿素含量、电解质渗漏电导率、CO2响应和光响应以及叶片营养元素含量的变化规律。

一些学者对病原物侵染作物后的组织结构变化情况进行了研究，不同的作物受到病原物侵染后，其细胞结构发生变化，仇硕等[20]研究了细菌性软腐病菌（Pectobacterium carotovora subsp. carotovora）侵染彩色马蹄莲后，造成叶片细胞亚显微结构和生理生化发生变化。刘艳涛等[21]发现，叶片厚度和栅栏组织厚度、叶绿素含量与‘鸭梨对黑星病（Venturia pirina）的抗性有密切的关系，这表明不同作物的不同部位组织结构影响了病原物的侵入。漆永红等[22]研究发现，青稞受到燕麦镰孢菌（Fusarium avenaceum）侵染后，发病叶片细胞膜和叶绿体均遭到严重破坏和断裂，叶肉细胞皱缩变形。本研究发现，腐烂茎线虫侵入当归根部，发病部位细胞受到严重破坏和断裂，表明一旦病原物与寄主建立寄生关系，其根系遭到破坏，会导致其内部细胞组织结构发生变化[23-24]。叶片通过光合作用合成自身代谢所需的能量和有机物[12]。一些研究报道，植物受到病原物侵染后净光合速率、气孔导度和叶片蒸腾速率等光合参数均降低[25-26]。本研究发现，当归受到腐烂茎线虫侵染后，净光合速率、气孔导度、蒸腾速率均降低，而胞间CO2浓度升高；发病当归的光饱和点、最大净光合速率、暗呼吸速率均降低，而光補偿点升高；发病当归的CO2饱和点降低，而CO2补偿点升高，这可能是由于当归受到病原线虫侵染后，能量在向上运输过程中导管被胼胝质、侵填体、胶质等物质堵塞影响了植株的光合作用，导致一些光合参数发生变化[27]。

本試验发现，发病当归叶片叶绿素含量有所降低，这与国内一些学者研究结果一致[28-29]，这是由于病原物产生的次生代谢产物对植株叶片功能有影响，导致叶片叶绿素含量及荧光参数降低。植物对氮、磷、钾的需求量高于其他营养元素，而其他微量元素对植物的产量增加、品质提升和病害的抗性也起到重要作用[30-31]。本试验发现，当归发生麻口病，叶片氮、磷、钾、锌、锰、铁含量降低，这可能是病原线虫侵染导致叶片光合速率和叶绿素含量降低，与植物光合作用有直接影响有关。同时研究发现，一些微量元素，如铜、钙、镁的含量反而增加，在这方面需要进一步研究。

综合以上，当归受腐烂茎线虫侵染，当归根部细胞结构遭到破坏，叶部细胞膜和叶绿体受损，叶片电解质渗漏电导率升高，叶绿素含量降低。腐烂茎线虫侵染后，当归病叶净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均降低，胞间CO2浓度升高；当归病叶光饱和点、最大净光合速率、暗呼吸速率和CO2饱和点等生理响应指标下降，叶片氮、磷、钾、粗蛋白、锌、锰、铁含量降低。

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