回温抑制鲜切马铃薯褐变及影响游离氨基酸代谢的研究

徐 鑫，姚 尧，王庆国，刘 佩

（山东农业大学食品科学与工程学院/山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东 泰安 271018）

0 引言

马铃薯营养全面丰富，是继水稻、小麦、玉米后中国第四大粮食作物，被称为“能源植物”、“地下苹果”、“第二面包”等[1]。马铃薯鲜切产品薯条、薯片、薯块等越来越受到人们的喜爱，市场消费量较大。但是鲜切马铃薯由于切割所造成的机械伤会引发一系列的生理生化变化，如褐变、失水、腐烂、异味等，其中褐变是影响鲜切产品质量的主要问题[2-3]。

多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)是鲜切马铃薯褐变的关键酶，研究表明通过人工合成小RNA的方法 沉 默 PPO 基 因 (StuPPO1、StuPPO2、StuPPO3、StuPPO4)能有效抑制马铃薯的褐变[4]。PPO和过氧化物酶(peroxidase，POD)能够氧化植物组织中酚类及氨基酸底物形成邻醌，醌自身的聚合以及与蛋白质、氨基酸等物质间的聚合可促进组织褐变的加重[5-6]。研究表明，马铃薯中游离酪氨酸是PPO 催化的主要底物[7]。然而，目前关于马铃薯其他内源性的游离氨基酸变化与酶促褐变之间关联性的研究还较少。Thybo[8]研究表明，游离天冬氨酸含量高的马铃薯品种鲜切后易褐变；Ali等[5]对鲜切马铃薯进行外源氨基酸涂抹实验，研究表明高浓度缬氨酸可与醌类形成褐色加合物加重褐变，半胱氨酸则与醌类形成无色加合物而减轻褐变[9]。

马铃薯采收后通常于2～4℃下低温贮藏，以减轻失水、发芽和腐烂从而延长马铃薯销售期。但经长时间低温贮藏的马铃薯，在鲜切加工过程中，表面更易发生褐变[10]。回温处理适用于经冷库低温贮藏的马铃薯，并具有诸多优势，如安全、高效、能减少低温贮藏导致的还原糖积累，减轻马铃薯在高温烘焙、油炸过程中与游离氨基酸发生美拉德反应，产生类黑素[11-12]等。前人研究发现回温处理对抑制鲜切苹果、洋姜和马铃薯褐变有较好的效果[13-15]，但褐变机理的相关研究并不深入，且马铃薯中游离氨基酸的变化与褐变之间的关联并不明确。

笔者针对低温贮藏后的马铃薯，采用20℃回温处理20 天，研究在回温及鲜切后低温贮藏过程中，马铃薯PPO 和POD 酶活性、游离氨基酸及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的变化，探究回温处理对鲜切马铃薯褐变控制的生理机制，旨在为鲜切马铃薯的贮藏保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用马铃薯品种为‘荷兰15号’，于2017年2月购于莱芜市杨庄镇聚富食品有限公司，已于2℃冷库贮藏8个月，纸箱内衬保鲜袋网套包装，运至山东省泰安市山东农业大学食品科学与工程学院2～4℃冷库。

1.2 主要仪器

恒温培养箱，济南科达尔实业有限公司；紫外分光光度计T6 新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司；2004-21(501)超级恒温水浴锅，国华仪器有限公司；Beckman Allegra 64R 高速冷冻离心机，美国Beckman公司；-80℃超低温冰箱，中科美菱；超声波振荡器，上海生析超声仪器有限公司；微型冷库，济南科达尔实业有限公司；CR-400 色差计，日本柯尼卡美能达仪器有限公司；液氮研磨仪，德国IKA 公司；高效液相色谱仪，日本岛津LC-20AT；C18液相色谱柱，日本岛津。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的制备 挑选180个大小一致、形状均匀、无机械损伤、无发芽、无绿变、无病虫害的马铃薯，将氯苯胺灵（质量浓度为30 mg/kg）溶于乙醇，与1 kg 细沙混匀后均匀地撒施于马铃薯表面，用于抑制马铃薯发芽。将马铃薯每10 个装入一个聚乙烯袋（尺寸为240 mm×350 mm）中，均分为2 组（每组9 袋马铃薯），一组为对照，于2～4℃冷库20 天；一组为回温处理组，于20℃恒温箱中处理20天；

每组9 袋马铃薯，其中6 袋用于回温处理前后取样，3袋马铃薯用于鲜切后观测及取样。

回温前、回温后2个取样点进行取样，每个取样点3个重复，取样后用液氮速冻，置于超低温冰箱(-80℃)中备用，样品用于PPO活性、POD活性、游离氨基酸和MDA含量的测定。

鲜切过程如下：将马铃薯用清水洗净，纱布擦干后，次氯酸钠溶液(200 μL/L)中消毒5 min；去皮，切成3～5 mm的薄片，放入50 μL/L的次氯酸钠溶液中消毒约15 s后用纱布吸干表面水分。将马铃薯切片随机混匀，分别装入13 个聚乙烯袋中（尺寸为175 mm×250 mm），每袋10 片马铃薯，袋口折叠，于2～4℃冷库中贮藏。

鲜切后观测及取样过程如下：对照和处理各7袋，在切后0、1、2、4、6、8、12 天分别进行拍照和色差测定。其余6袋在切后0、0.5、1、2、4、6天取样，每个取样点3个重复，用液氮冷冻并放入-80℃超低温冰箱，分别用于PPO活性、POD活性、游离氨基酸和MDA含量的测定。

1.3.2 褐变度等级评定与标准制定 将不同褐变程度的马铃薯片进行比较，制定了马铃薯褐变程度的等级标准。1=无褐变；2=轻微褐变（面积≤5%）；3=中度褐变（5%＜面积≤20%）；4=褐变较严重（20%＜面积≤50%）；5=褐变严重（面积＞50%）。

1.3.3 色差测定 对不同褐变程度的马铃薯片进行色差测定。每个重复随机取8片，每个处理3个重复。使用柯尼卡美能达公司的CR-400 色差计测定马铃薯切片粗糙面的颜色值(L*、a*)，每次测定前以标准白度(L*=97.06，a*=0.04)对色差计进行校准。

1.3.4 PPO 活性测定 粗酶液的提取及PPO 酶活性测定参考Baltacioğlu等[16]的方法并加以改进。依次向试管中加入2 mL pH 6.8 的磷酸缓冲液、20 mmol/L 邻苯二酚溶液1 mL、粗酶液0.4 mL，混匀后，立即测定在420 nm 下的吸光值每30 s 的变化，测定连续6 组数据。以1 g 马铃薯样品（鲜重）每分钟吸光度值变化0.01为1个酶活性单位(U)。

1.3.5 POD 活性测定 采用愈创木酚比色法[17]测定POD酶活性。以1 g马铃薯样品（鲜重）每分钟内吸光度变化为1 个酶活性单位(U)。POD 活性的测定波长为470 nm。

1.3.6 游离氨基酸含量测定 马铃薯游离氨基酸的提取参考Kumar 等[18]的方法，分别配制16 种游离氨基酸（酪氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸）标准样品(0.1 mg/mL)。游离氨基酸样品的分析采用日本岛津LC-20AT 高效液相色谱，色谱柱型号为Inertsil ODS-3 5020-01731，方法参照轻工行业标准QB/T 4356—2012[19]。

1.3.7 MDA含量测定 称取1 g马铃薯样品，加入4 mL 10%三氯乙酸，匀浆后4℃、10000 r/min 离心15 min 得到上清待测液。MDA 含量参照硫代巴比妥酸煮沸法测定[20]。

图1 鲜切马铃薯褐变等级

表1 褐变等级标准及相关色差值

1.4 数据分析

所有实验均重复3 次，不同处理方法间的数据使用SPSS 17 软件的邓肯法进行显著性差异分析，显著性水平为0.05，使用Excel 2010软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 鲜切马铃薯褐变等级标准的制定

马铃薯经低温贮藏后，鲜切加工过程易发生褐变，在开发马铃薯褐变抑制方法的过程中，为了更好地对马铃薯褐变进行观察记录，首先制定了鲜切马铃薯褐变等级标准，并测定了相应的马铃薯片表面的L*和a*值，如图1、表1所示，后续实验过程中鲜切马铃薯的褐变均严格参照此标准进行评定。

2.2 回温处理对鲜切马铃薯褐变程度及L*、a*值的影响

低温贮藏后的马铃薯块茎于20℃回温20天，鲜切后低温贮藏期间，进行观察并拍照（图2）。由图2 可知，对照2天即出现较严重褐变，而回温处理的马铃薯鲜切后8天仍具有较好的色泽，未发生褐变，货架期延长了6天。

分别在鲜切0、1、2、4、6、8、12 天进行了色差L*、a*值测定。如图3所示，鲜切后低温贮藏期间，对照组马铃薯片2 天内L*值快速下降，而经回温处理后的马铃薯鲜切片L*值8 天内均下降缓慢，并一直维持在70 以上，显著高于对照组(P＜0.05)；由图3B可知，与对照相比，回温处理显著降低了马铃薯片a*值的上升(P＜0.05)。

由图2～3 可知，回温处理显著提高了鲜切马铃薯L*值，降低了a*值，显著抑制了表面褐变的发生，有利于保持鲜切马铃薯表面原有的色泽和亮度，延长货架期。

2.3 回温处理对马铃薯PPO酶和POD酶活性的影响

在有氧条件下，PPO 可催化内源性酚类底物生成醌，醌类物质聚合产生黑色素，是引起马铃薯褐变的主要因素[21-22]；POD 亦是参与酚氧化的主要酶类之一[6]。分别测定了马铃薯回温过程中以及鲜切后的PPO 和POD 酶活。如图4A 所示，与对照相比，回温前后PPO酶活性变化并不显著；但鲜切后低温贮藏期间，经回温处理的马铃薯片PPO 酶活性均一直显著低于对照(P＜0.05)。由图4B 可见，与对照相比，回温前后POD酶活性并无显著变化；但鲜切后，经回温处理的马铃薯片POD活性始终低于对照(P＜0.05)。

2.4 回温处理对马铃薯游离氨基酸含量的影响

在马铃薯中，游离酪氨酸是PPO催化的主要酚类底物[7]，酪氨酸的氧化往往造成鲜切马铃薯表面红褐色以至黑色褐变的形成。而不同氨基酸对马铃薯鲜切褐变的影响并不相同[5]，为了探究马铃薯中内源性游离氨基酸与酶促褐变的关系，用高效液相色谱法测定了鲜切马铃薯中16种游离氨基酸的含量，并对总游离氨基酸含量及发生显著变化的7种游离氨基酸进行了分析。

图2 回温处理对鲜切马铃薯褐变的影响

图3 回温处理对鲜切马铃薯L*和a*值的影响

图4 回温处理对马铃薯PPO酶和POD酶活性的影响

对照在低温贮藏20天过程中，总游离氨基酸含量呈下降趋势，如图5 所示，而经回温处理的马铃薯，回温后总游离氨基酸的含量降低更为显著；因此，经回温后的马铃薯，鲜切时初始游离总氨基酸的含量显著低于对照组。

如图6A～E所示，经回温处理的马铃薯，鲜切初始的（即鲜切0 天）游离酪氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丙氨酸的含量均显著低于对照组。在鲜切后贮藏期间，回温处理组马铃薯游离酪氨酸含量，除第4 天，均显著低于对照组(P＜0.05)；游离丝氨酸含量一直显著低于对照组(P＜0.05)；鲜切后2天内，游离天冬氨酸含量显著低于对照(P＜0.05)；鲜切后3天内，游离丙氨酸含量显著低于对照(P＜0.05)。如图6F 所示，回温后，处理组与对照组马铃薯游离甘氨酸含量并无显著差异；但从鲜切后12 h到4天间，回温处理提高了马铃薯游离甘氨酸的含量。其余8 种游离氨基酸，包括游离苏氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等，在回温后以及鲜切过程中与对照相比均无显著性差异(P＞0.05)。游离半胱氨酸在处理组和对照组马铃薯中均未检出。

图5 回温处理对马铃薯总游离氨基酸含量的影响

2.5 回温处理对马铃薯游离脯氨酸和MDA含量的影响

在对单一游离氨基酸进行分析的过程中发现，经回温处理的马铃薯回温后及鲜切过程中，游离脯氨酸含量呈上升趋势，且显著高于对照(P＜0.05)，如图7A。植物脯氨酸含量的增加往往会影响植物抗氧化能力[23]。对马铃薯MDA 含量测定如图7B 所示，结果表明对照马铃薯鲜切后，短时间内MDA 含量快速上升，但经回温处理的马铃薯鲜切后，MDA 含量增速缓慢，并在整个鲜切后贮藏期间，始终显著低于对照组。

3 结论

回温处理能有效抑制鲜切马铃薯褐变，显著降低PPO和POD酶活性，降低鲜切初始游离总氨基酸的含量，主要包括游离酪氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丙氨酸等；增加了鲜切过程中游离甘氨酸含量；游离脯氨酸的含量在回温和鲜切后均显著上升；此外，回温显著降低了鲜切后马铃薯MDA含量。因此回温处理通过降低PPO和POD酶活性，减少了褐变底物游离酪氨酸及其他游离氨基酸（包括游离缬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、丙氨酸）含量，提高了游离甘氨酸的含量，增强了游离脯氨酸以及降低MDA 含量，从而更好地保护细胞膜完整性，抑制了低温贮藏后马铃薯的鲜切褐变。

图6 回温处理对马铃薯6种游离氨基酸含量的影响

图7 回温处理对马铃薯游离脯氨酸和MDA含量的影响

4 讨论

4.1 回温处理可以有效地抑制鲜切马铃薯表面褐变

低温贮藏的马铃薯鲜切后表面易发生褐变，且随着贮藏时间的延长褐变加重[10]。张兵兵等[15]的研究结果表明，对‘荷兰15 号’马铃薯进行不同温度的回温，均能有效抑制鲜切马铃薯表面的褐变。本研究中，对低温贮藏8个月的‘荷兰15号’马铃薯进行20℃回温处理20天后鲜切，回温处理显著提高了鲜切马铃薯片L*值、降低了a*值，鲜切后8天仍具有较好的色泽。针对于低温贮藏马铃薯，在鲜切加工过程褐变显著的问题，回温处理可以有效地减缓鲜切后马铃薯的褐变，更好地延长货架期。然而曹裕[24]的研究表明，低温贮藏大于10个月的‘荷兰7号’马铃薯，经回温处理并没有显著抑制鲜切马铃薯表面的褐变。也进一步说明，20℃条件下长时间的回温处理，往往需要在使用前进行抑芽剂处理，且低温贮藏期过长，贮藏过程中发生霉变、发芽、失水、萎蔫等较严重的马铃薯并不适宜。

4.2 回温处理有效地抑制鲜切马铃薯PPO、POD酶活性并降低部分游离氨基酸的积累

PPO 氧化组织中内源性底物形成邻醌，邻醌再相互聚合或与蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而使组织发生褐变[5]，而回温处理降低了鲜切马铃薯PPO酶活性，显著地抑制了褐变的发生；回温处理还可以抑制切后马铃薯POD活性，可能是因为回温处理减少了机械伤产生的自由基尤其是活性氧的产生和积累，从而减轻了体内自由基对POD酶的催化作用[25]。

游离酪氨酸作为主要酚类底物，往往会在PPO催化下直接参与马铃薯鲜切褐变[7]；Thybo[8]研究发现，天冬氨酸含量高的马铃薯品种鲜切后更易褐变；Ali等[5]用外源氨基酸处理鲜切马铃薯，研究结果表明1 mol/L缬氨酸溶液加重褐变而10 mmol/L的甘氨酸溶液能轻微地减轻褐变。然而马铃薯中诸多游离氨基酸与褐变的关系并不明确。本研究中，回温处理减少了鲜切后马铃薯褐变底物游离酪氨酸的积累，游离天冬氨酸含量显著降低，并在鲜切后贮藏2天前显著低于对照；游离缬氨酸的含量在回温后及切后贮藏期间，均显著低于对照，说明回温处理减少了马铃薯中内源性的游离缬氨酸的含量，进而有效减少了与醌类结合生成褐色物质；游离甘氨酸含量回温后中无显著变化，但在鲜切贮藏前期，游离甘氨酸的含量显著高于对照(P＜0.05)。另有游离丝氨酸在回温后及切后贮藏期间，均显著低于对照(P＜0.05)；游离丙氨酸在鲜切贮藏前期显著低于对照组。通过研究回温对游离氨基酸代谢的影响，初步探讨了游离氨基酸与鲜切马铃薯褐变之间的关联。后期笔者可针对回温处理过程中变化显著的氨基酸，应用外源氨基酸处理鲜切马铃薯，探讨其对鲜切马铃薯褐变的影响；另一方面可从马铃薯内源游离氨基酸的代谢通路着手，分析回温对氨基酸代谢通路影响的分子机制。

4.3 回温处理可以有效地增加脯氨酸、抑制MDA的积累

脯氨酸积累可以提高植物抗性，有效清除细胞损伤产生的活性氧，增强细胞的抗氧化能力[23]。苏贝贝等[26]研究表明，外源脯氨酸处理可以提高半夏的抗氧能力，提高细胞对活性氧的清除能力。Toivonen 等[13]研究表明经过回温处理的苹果可以减少鲜切后细胞膜的损伤。研究表明，回温处理显著提高了马铃薯中渗透物质游离脯氨酸的积累，有利于增强细胞抗氧化能力，提高马铃薯抵御胁迫、机械伤害的能力。回温处理后，脯氨酸含量的提高，MDA含量的降低，使得马铃薯在鲜切或遭遇机械伤害的时候，更有利于维持细胞膜结构的完整性，减少鲜切造成的细胞膜损伤，有效地抑制褐变的发生。后期通过分析并研究回温对脯氨酸合成、降解基因表达的影响，对抗氧化体系防护酶基因表达及活性的影响，对细胞膜稳定相关蛋白基因表达的影响，进一步探讨回温抑制鲜切马铃薯褐变的分子机制。