伤处理抑制鲜切马铃薯褐变的技术及机理研究

王红颖，刘博文，王庆国，马玉荣,刘 佩

（山东农业大学食品科学与工程学院/山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东泰安271018）

0 引言

鲜切马铃薯因新鲜、方便、卫生、营养等特点，广受消费者喜爱。目前，国内鲜切产品主要以市场消费量较大的马铃薯丝、薯块、薯条、薯片等为主。随着马铃薯主粮化政策的推动以及居民消费方式的转变，鲜切马铃薯行业将会有长足发展；但鲜切马铃薯在加工及后期贮藏过程中极易褐变，褐变很大程度上影响了鲜切马铃薯的商品质量，缩短其货架期[1]。控制鲜切马铃薯褐变的方法主要包括气调、真空包装、热水处理等物理措施[2-4]，以及化学抑制剂包括柠檬酸、抗坏血酸、氯化钙和氨基酸等外源浸泡处理[5-8]。然而鲜切马铃薯真空包装容易产生异味，热处理温度过高、时间过长等均会造成鲜切马铃薯热损伤[3-4]；而化学试剂因直接接触马玲薯丝，产品安全性以及对产品风味的影响往往限制了其广泛应用[9]。因此，寻找安全有效的褐变控制技术是当前鲜切马铃薯技术开发及研究的重点。

酚类底物的酶促氧化是鲜切马铃薯褐变的主要原因[10]，多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是催化酚类酶促氧化最主要的酶[11]，而苯丙氨酸解氨酶(phenylal aninammonialyase，PAL)是酚类化合物合成中的关键酶。热激处理、1-MCP 处理、γ-射线处理等褐变抑制方法，主要是通过抑制PPO、PAL 酶活性，抑制鲜切荸荠、马铃薯及冬瓜褐变[12-14]。果蔬在鲜切加工过程中，细胞膜遭受伤害而损伤，细胞组织结构受到破坏，局部O2浓度提高，PPO活性上升，引起酶促褐变加强[15-16]。茉莉酸甲酯、硫化氢及热水处理显著提高了莲藕、马铃薯及苹果等果蔬抗氧化酶活性而抑制其鲜切褐变[17-19]；抗氧化酶活性的上升往往有利于保护质膜免受氧化损伤、稳定细胞膜完整性，进而有利于维持酚类底物及酶的区隔化分布，显著降低酚类的酶促褐变[20-21]。

植株受到局部损伤后，伤害刺激信号会通过脱落酸、水杨酸、H2O2、茉莉酸等信号分子将应激信号从局部传至整个植物，最终引发植物体一系列防御物质的代谢及防御酶活性的改变，而防御酶包括超氧化物歧化 酶 (superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和过氧化物酶(peroxidase，POD)等酶活性的上升可诱导植物产生抗性，进而增强植物生长过程中抵御伤害、逆境等生物胁迫的能力[22-25]。本研究在鲜切加工前对马铃薯进行适当的伤处理，试图激活马铃薯块茎自身的防御体系，通过提高其抗氧化防御能力，进而抑制鲜切引发的褐变。

笔者希望通过研究伤处理方式及放置时间、温度对鲜切马铃薯褐变的影响，开发安全有效的褐变控制技术，并通过对PPO、PAL、总酚及抗氧化相关指标的测定，进一步探讨伤处理对鲜切马铃薯褐变抑制的机理。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用‘荷兰15号’马铃薯于2015年6月采收，购于莱芜市杨庄镇聚富食品有限公司，运回山东农业大学食品科学与工程学院冷库(2～4℃)贮藏。挑选大小一致（200 g 左右，长度12～14 cm）、形状均匀、无病虫害、无机械损伤、无发芽绿变的马铃薯作为实验材料。

1.2 主要仪器

ML204天平(1/10000)，瑞士梅特勒-托利多公司生产；S220 pH 计，瑞士梅特勒-托利多公司生产；Allegra 64R 高速冷冻离心机，美国 Вeckman 公司；T6 新世纪紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司生产；恒温水浴锅，常州国华电器有限公司生产；CR-400色差计，柯尼卡美能达公司生产；恒温箱，济南科达尔有限公司生产；微型冷库，济南科达尔实业有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 伤处理 马铃薯经20℃回温10 h 后进行伤处理。第1组采用切伤方式，在马铃薯块茎两端用切菜刀（刀面110 mm×170 mm）切下1～1.5 cm 厚的薯块。第2 组采用刮伤方式，在马铃薯两端用刮皮刀刮掉厚约0.5 mm 的表皮。将伤处理后的马铃薯于20℃放置18 h，然后进行鲜切。每组处理设3 个重复，每个重复10个马铃薯。对照组不做伤处理，其他操作相同。

1.3.2 马铃薯鲜切加工流程 将伤处理后的马铃薯清洗后，用2 mL/L 的次氯酸钠溶液消毒5 min，然后削皮、切成3～5 mm厚的马铃薯片。马铃薯片用0.5 mL/L的次氯酸钠溶液消毒30 s 后用干净纱布吸干表面水分，装入聚乙烯袋中（尺寸为175 mm×250 mm，厚度为0.04 mm）并折叠袋口。装袋时每袋装12片（约200 g），每个重复9袋，放入2～4℃冷库中贮藏。分别在鲜切后0、2、4、6、8天进行褐变程度评定。

1.3.3 伤处理后最佳放置条件筛选 用上述刮伤方式进行马铃薯伤处理，然后分别在5、20℃下放置12、18、36 h。每组处理设3个重复，每个重复10个马铃薯。对照组不做伤处理，其他操作相同。处理结束后按照马铃薯鲜切加工流程进行鲜切处理。分别在0、2、4、6、8天进行褐变程度评定。

1.3.4 鲜切马铃薯感官评定及表面颜色测定

（1）鲜切马铃薯感官评定标准。每组处理鲜切马铃薯由8人按照表1～2的评分标准[26]进行评定。

（2）鲜切马铃薯表面颜色的测定。采用CIE L*法测定鲜切马铃薯的表面颜色[26]。色差计(CR-400,Minolta Co., Osaka)使用前用标准白板(L*=97.06，a*=0.04，b*=2.01)校准。分别在切片后第0、1、3、5、7 天测定马铃薯切片粗糙表面的色差。测定时，每个处理3个平行，每个平行取8片马铃薯片。

表1 鲜切马铃薯褐变程度评定标准

表2 鲜切马铃薯感官评定标准

1.3.5 PPO、PAL及总酚含量测定

（1）PPO活性测定。称取1 g马铃薯样品和0.05 g聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，加入3 mL 0.1 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.86)，匀浆后4℃、10000 r/min 离心15 min得到粗酶液。PPO活性参考邻苯二酚法测定[27]。

（2）PAL 活性的测定。称取1 g 马铃薯样品和0.05 g PVPP，加入4 mL 0.1 mmol/L 硼酸缓冲溶液(pH 8.5)，匀浆后 4℃、10000 r/min 离心 15 min 得到粗酶液。PAL活性参照苯丙氨酸比色法测定[28]。

（3）总酚含量测定。称取1 g 马铃薯样品，加入4 mL 70%的丙酮，匀浆；避光条件下，浸提3 h 后4℃、10000 r/min 离心15 min 得到待测上清液。总酚含量的测定参考福林酚法测定[29]。

1.3.6 抗氧化酶活性测定

（1）POD 活性的测定。称取1 g 马铃薯样品和0.05 g PVPP，加入5 mL 0.1 mmol/L 磷酸缓冲溶液(pH 6.0)，匀浆后 4℃、10000 r/min 离心 15 min 得到待测上清液。POD活性测定参照愈创木酚法测定[27]。

（2）SOD 活性的测定。称取1 g 马铃薯样品和0.05 g PVPP，加入5 mL 0.1 mmol/L 磷酸缓冲溶液(pH 7.8)，匀浆后 4℃、10000 r/min 离心 15 min 得到待测液。SOD活性参照光还原法测定[30]。

1.3.7 DPPH自由基清除率和MDA含量测定 称取1 g马铃薯样品，加入4 mL 95%乙醇，匀浆后过滤得到待测滤液。DPPH自由基清除率测定参考勾明玥等[31]的DPPH测定方法。

称取1 g马铃薯样品，加入3 mL 10%三氯乙酸，匀浆后4℃、10000 r/min 离心15 min 得到待测液。MDA含量参照硫代巴比妥酸煮沸法测定[32]。

1.4 数据分析

所有样品均设3个重复。平均值及标准偏差通过Excel 2010进行数据整理分析，表示为平均值±标准偏差。单因素方差分析(ANOVA)通过SPSS 22.0统计分析软件计算。样品平均值之间的差异通过邓肯多重比较进行检验。

2 结果与分析

2.1 不同伤处理条件对鲜切马铃薯褐变程度的影响

2.1.1 2种伤害方式对鲜切马铃薯褐变程度的影响 分别对马铃薯进行2种伤处理，于20℃放置18 h，然后进行鲜切，鲜切片在2～4℃冷库中贮藏8 天，褐变程度变化见图1。对照组马铃薯鲜切后随着贮藏时间延长，褐变程度逐渐加重；而2 种伤处理均能显著抑制鲜切马铃薯褐变。切伤方式处理的鲜切马铃薯贮藏4天后开始褐变（图1A）；刮伤方式处理的鲜切马铃薯在8天有轻微褐变（图1В）。鉴于以上结果，后续研究选用刮伤方式进行马铃薯伤处理。

2.1.2 伤处理后放置不同温度及时间对鲜切马铃薯褐变的影响 采用刮伤方式对马铃薯进行伤处理后，将其于5、20℃分别放置12、18、36 h，再进行鲜切，鲜切后贮藏8天期间，其褐变程度如图2所示。由图2A可知，伤处理后5℃放置18 h，鲜切马铃薯褐变程度低于对照组，但差异并不显著。由图2В 可知，伤处理后20℃放置18、36 h，鲜切马铃薯褐变程度均显著低于对照组。

采用刮伤方式对马铃薯进行伤处理后，将其于20℃下分别放置18、36 h，再进行鲜切，进一步优化并筛选最佳褐变抑制条件，结果如图3～4所示：伤处理后于20℃放置18 h，其鲜切马铃薯褐变程度显著低于对照，且鲜切马铃薯低温贮藏6 天内基本无褐变，8 天仅有轻微褐变发生，仍具有较好的商品价值。而伤处理后于20℃放置36 h，其鲜切马铃薯4 天内褐变程度与对照无显著性差异，4～8天褐变程度显著低于对照，在贮藏8 天时出现中度褐变。综上所述，采用刮伤方式对马铃薯进行伤处理并于20℃下放置18 h能够显著抑制鲜切后马铃薯褐变。

图1 2种伤害处理方式对鲜切马铃薯褐变程度的影响

图2 刮伤方式处理后不同放置温度及时间对鲜切马铃薯褐变程度的影响

图3 刮伤方式处理后20℃放置18、36 h对鲜切马铃薯贮藏8天褐变的影响

图4 刮伤方式处理后20℃放置18、36 h对鲜切马铃薯褐变程度的影响

2.2 伤处理对鲜切马铃薯感官品质及生理指标的影响

由2.1结果可知，采用刮伤方式（即在马铃薯两端用刮皮刀刮掉厚约0.5 mm的表皮）对马铃薯进行伤处理，并于20℃放置18 h，然后再实施鲜切，能够显著抑制鲜切马铃薯褐变，延长货架期。后续研究将进一步针对于伤处理后20℃放置18 h，探讨其对马铃薯鲜切褐变的抑制机理。

2.2.1 伤处理对鲜切马铃薯感官品质的影响 伤处理后20℃放置18 h 对鲜切马铃薯总体感观质量、褐变度及L*值的影响见图5。鲜切马铃薯表面颜色L*值与表面褐变存在显著的相关性[33]。由图5A～В 可知，随着贮藏时间延长，鲜切马铃薯的褐变程度逐渐上升而L*值逐渐下降；整个贮藏期间，处理组鲜切马铃薯L*值显著高于对照，而褐变程度显著低于对照。由图5C 可知，鲜切马铃薯总体感官质量随贮藏时间延长逐渐下降，对照组鲜切马铃薯总体感官质量1天就迅速降低，3天已完全失去商品价值；伤处理组的鲜切马铃薯总体感官质量下降较为缓慢，鲜切7天仍具有商品价值，与对照相比延长货架期可达4天。

2.2.2 伤处理对鲜切马铃薯PPO、PAL和总酚含量的影响 伤处理对鲜切马铃薯PPO、PAL和总酚含量的影响如图6所示。鲜切前，伤处理组马铃薯PPO、PAL酶活力及总酚含量与对照相比略有升高，但差异不显著；而鲜切后，伤处理组PPO、PAL 酶活力、总酚含量均显著低于对照组。

综上所述，伤处理后20℃放置18 h 可以显著降低鲜切过程PPO、PAL酶活及总酚含量，提高鲜切马铃薯的总体感观质量、抑制鲜切马铃薯表面褐变，延长货架期。

2.2.3 伤处理对鲜切马铃薯抗氧化体系的影响 伤处理后20℃放置18 h对鲜切马铃薯POD、SOD酶活，DPPH清除率及MDA 含量的影响如图7 所示。伤处理显著增加了POD、SOD 酶活力及DPPH 清除率，显著减缓了MDA 含量的上升，有力地提高了鲜切马铃薯抗氧化防护体系。

3 结论

实验分别探讨了伤处理方式、伤处理后放置的温度、时间等条件对鲜切马铃薯褐变的影响，结果表明2种伤处理方式（切伤和刮伤）均能显著抑制鲜切马铃薯褐变，且伤处理后于20℃放置18 h能够显著抑制鲜切马铃薯褐变，具有较好的总体感官质量和表面颜色，延长货架期4天。伤处理通过抑制PPO、PAL酶活力，减少褐变底物总酚的积累，提高贮藏期间抗氧化酶POD、SOD 酶活力，增加DPPH 自由基清除能力并降低鲜切马铃薯MDA含量，从而显著抑制鲜切马铃薯褐变。

图5 伤处理对鲜切马铃薯褐变程度、表面颜色L*值及总体感官质量的影响

图6 伤处理对鲜切马铃薯PPO活性、PAL及总酚含量的影响

4 讨论

4.1 伤处理能够很好的抑制鲜切马铃薯褐变

伤处理是在马铃薯进行鲜切前，给予马铃薯一定的伤处理，这种方式能够有效地抑制鲜切马铃薯褐变，且安全、省力，不需要耗费能源、添加外源化学试剂等，该技术方法没有药剂残留，对鲜切马铃薯的风味及安全性无不良影响，为抑制鲜切马铃薯加工及贮藏期间的褐变问题提供了一种新的技术方法。

4.2 伤处理抑制鲜切马铃薯褐变的机制

PPO 和PAL 是影响鲜切产品褐变的关键酶，其活性的增加往往会促进酶促褐变[34-35]。王擎等[36]研究发现，曲酸处理通过抑制PPO 和PAL 酶活性，减轻了鲜切马铃薯及莲藕的褐变。冯岩岩等[37]关于NO处理抑制鲜切牛蒡褐变的研究表明，PPO 及PAL酶活性的显著降低是褐变减轻的重要原因。本研究中伤处理降低了鲜切马铃薯PPO、PAL 的酶活力从而减少总酚的酶促氧化，显著抑制了褐变的发生。

图7 伤处理对鲜切马铃薯POD活性、SOD活性、DPPH自由基清除率及MDA含量的影响

POD 和SOD是植物防御酶体系的重要成员，在清除活性氧及其他过氧化物自由基，保护细胞免受氧自由基毒害等方面发挥着重要作用[38]。机械伤害易诱导植物SOD、POD、CAT等抗氧化防护酶活性的上升，而抗氧化防护酶活性的提高有利于抑制鲜切果蔬褐变[39]。姜爱丽等[40]研究发现机械伤诱导了大蒜中SOD、POD 和CAT 抗氧化酶活性的升高，提高了DPPH 自由基清除能力。刘艳等[41]研究发现，机械伤害能诱导豌豆叶片的防御反应，提高抗氧化酶类活性，降低膜脂过氧化水平，减轻活性氧损伤。苏晶等[42]研究表明，机械伤可以诱导采后苹果防御酶POD 活性增加。较高的抗氧化活性可以清除活性氧自由基，防止膜脂过氧化，同时植物组织中有较高的还原势，可以将氧化形成的醌类物质还原或转化，避免醌与氨基酸、蛋白质等进一步的聚合反应，从而显著抑制褐变[40]。DPPH 自由基清除率常用于评价非酶类抗氧化活性[43]，其上升有利于抑制酶促褐变[44]。MDA是膜脂过氧化产物，其含量的增加意味着膜脂过氧化程度的增强；果蔬MDA含量降低，往往有利于膜脂稳定，而膜完整性的保持可以维持酚和底物的区隔化分布，避免两者接触从而抑制褐变[45-46]。

而对马铃薯进行伤处理并于20℃放置18 h，显著增加了SOD、POD 酶活性，提高了鲜切马铃薯DPPH自由基清除能力，降低自由基对细胞膜的氧化损伤，抑制了MDA 含量的升高，有利于维持组织内氧化还原稳态，进而抑制鲜切马铃薯褐变。

4.3 马铃薯中伤信号转导研究

植株受到机械损伤后会有一套完整的防御系统来应对损伤刺激，应激信号通过信号分子诱导植物抗性反应。植物受到机械伤害后，在数分钟或数小时内便会发生伤信号转导，激活防御反应体系。在植物诱导自身抗性反应的过程中，信号分子发挥重要作用。信号分子的传递和级联放大作用将应激信号从局部传至整个植物，最终导致一系列防御基因的表达、防御物质的代谢及防御酶活性等发生改变，诱导植物产生抗性[42]；参与伤害反应的信号分子主要有水杨酸、乙烯、H2O2、茉莉酸(jasmonic acid，JA)等[47-50]。如JA是植物体内重要的信号转导物质，当植物受到胁迫时，细胞内JA 含量快速升高，可以启动JA 应答基因的表达，提高植物对机械损伤和病虫害的抗性[49]。刘佳妮等[51]研究发现，蛾取食伤害会激活马铃薯块茎JA介导的信号转导途径，诱导防御酶POD、CAT 酶基因表达量上升。本研究后续可以通过对信号分子如JA 类物质含量的测定及相关基因表达的分析，进一步探讨伤处理抑制鲜切马铃薯褐变的分子机制。