云南西盟蔗区发现检疫性病害甘蔗白叶病

张荣跃　李文凤　黄应昆　王晓燕　单红丽　李婕　仓晓燕　罗志明　尹炯

摘要：研究旨在明确2018年在云南西盟蔗区发现的甘蔗病害是否为植原体引起的甘蔗白叶病。使用植原体16S rRNA基因序列通用引物Pl/P7和R16F2n/R16R2对10份采自云南西盟蔗区的疑似甘蔗白叶病样品进行巢氏PCR检测，并将巢氏PCR产物进行克隆测序和序列分析。巢氏PCR结果表明：所有10份样品均能扩增得到1240 bp左右的片段。测序结果表明所有获得的10条16S rRNA基因序列大小均为1247 bp，序列间的核苷酸一致性为100%。BLASTN分析表明，从病株扩增到的所有核苷酸序列与先前云南临沧甘蔗白叶病植原体分离物LC7和LC9的16S rRNA基因序列（Genbank登陆号：KR020691和KR020692）的核苷酸序列一致性为100%。虚拟RFLP分析表明，西盟分离物的16S rRNA基因序列的酶切图谱与16SrXI-B亚组植原体相同。本研究结果表明，云南西盟蔗区发现的甘蔗病害为16SrXI-B亚组植原体引起的甘蔗白叶病。

关键词：云南;西盟;检疫性病害;植原体;甘蔗白叶病;16SrXI-B亚组

中图分类号：S435.661

文献标志码：A

论文编号：cjas18120017

0引言

甘蔗白叶病（Sugarcane White Leaf， SCWL）是由植原体引起的甘蔗毁灭性病害，该病于1954年首次在泰国发现[1]，现己广泛发生于越南、緬甸、菲律宾、巴基斯坦、印度、斯里兰卡等植蔗国家，给当地甘蔗和制糖产业造成了巨大的经济损失[2-8]。中国台湾于1962年报道了该病的发生[9]，2013年Li等[10]首次在云南保山蔗区采集的甘蔗样品上检测发现SCWL植原体。SCWL主要症状表现为叶片白化、分蘖增多和矮化[11]。SCWL植原体主要通过带病蔗种进行远距离传播，且传播性极强，此外，在田间SCWL植原体还可通过叶蝉自然传播[4，12-13]。先前的病原多样性研究表明16SrXI-B亚组和16SrXI-D亚组植原体均可引起SCWL[14-15]。

目前，SCWL只在云南保山蔗区和临沧蔗区发现[5-17]。2018年6月，笔者在对云南西盟蔗区甘蔗病虫害进行调查时，发现疑似SCWL症状的植株。为明确病原，笔者采集了10份疑似SCWL病样，采用植原体16S rRNA基因序列通用引物对Pl/P7和R16F2n/R16R2对疑似病株进行了检测鉴定。以期为科学有效防控SCWL提供理论依据和技术支撑。

1材料与方法

1.1疑似SCWL样品

2018年6月从云南西盟蔗区采集的10份疑似SCWL样品，品种均为‘粤糖93-159。

1.2植物总DNA的提取

每个样品取病叶0.2 g，采用北京全式金生物技术公司的Easy Pure plant Genomic DNA Kit植物DNA提取试剂盒提取叶片总DNA，具体方法步骤按照说明书进行。

1.3巢式PCR检测

使用植原体16S rRNA基因序列通用引物对Pl/P7[18]和Rl6F2n/Rl6R2[14]进行巢氏PCR扩增。以Pl/P7为引物进行第一次PCR扩增，25 uL反应体系为含有lOxPCR Buffer 2.5 uL、引物Pl/P7（20 umol/L）各l uL、MgCl2 （25 mmol/L）2 uL、dNTPs （10 mmol/L） 2.0 uL、Taq酶（5 U/uL） 0.2 uL、ddH20 15.3 uL、DNA模板1.0 uL。PCR反应条件为：940C预变性3 min; 94℃变性30 s，55CC退火30 s，72℃延伸l min，35个循环;最后72℃延伸10 min。取l uL第一次PCR扩增产物（稀释30倍）作为模板，R16F2n/R16R2为引物进行第二次PCR扩增，反应体系与第一次PCR相同，扩增程序为：940C预变性3 min; 94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸l min，35个循环;最后72C延伸10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 PCR产物克隆、测序及序列分析

利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）回收目的片段，并将其与pEASY-T5（北京全式金生物技术有限公司）进行连接转化，每个转化挑选6个阳性克隆送华大基因测序。测序结果使用BLASTN进行对比。使用DNAMAN v6.0进行序列一致性分析。

1.5 16S rRNA基因序列的虚拟RFLP分析

使用在线植原体分类工具iPhyClassifier（http：//plantpathology. Ba. Ars. usda. gov/cgibin/ resource/iphyclassifier.cgi）对西盟SCWL植原体的16S rRNA基因序列进行虚拟RFLP分析和相似性系数分析[19]。

2结果与分析

2.1巢式PCR检测及序列分析

使用植原体16S rRNA基因序列通用引物对Pl/P7和R16F2n/R16R2的巢氏PCR扩增结果表明10份疑似SCWL样品和阳性对照均检测到约1.2 kb左右的条带，与预期目标片段大小一致（图1）。将目标片段回收、克隆和测序，测序结果表明，所有样品扩增出的特异性片段大小均为1247 bp，序列间的核苷酸一致性为100%。BLASTN分析结果表明，所有10条序列（Genbank登陆号：MK028610-MK028619）与先前云南临沧SCWL植原体分离物LC7和LC9的16S rRNA基因序列（Genbank登陆号：KR020691和KR020692）的核苷酸序列一致性为100%。

2.2 16S rRNA基因序列的虚拟RFLP分析

利用植原体分类鉴定在线工具iPhyClassifier对本研究获得的16S rRNA基因序列进行虚拟RFLP分析，结果表明，本研究获得的16S rRNA基因序列的虚拟RFLP酶切图谱与16SrXI-B亚组植原体的虚拟RFLP酶切图谱相同（图2），图谱的相似系数为1.00。

3结论与讨论

本研究对云南西盟蔗区采集的10份疑似SCWL甘蔗样品进行巢式PCR检测及测序分析，BLASTN结果表明本研究扩增获得的序列为SCWL植原体16SrRNA基因序列，虚拟RFLP分析表明本研究获得的SCWL植原体分离物为16SrXI-B亚组植原体，因此，本次云南西盟蔗区发现的甘蔗病害可以确诊为16SrXI-B亚组植原体引起的SCWL。西盟蔗区也成为继云南保山蔗区和临沧蔗区外又一个发现SCWL的蔗区。本研究结果可为云南今后开展SCWL的深入研究和科学有效防控奠定基础和提供参考依据。

SCWL是一种及其危险的甘蔗病害，可对甘蔗造成毁灭性灾害。Li等[20]2013年在云南保山蔗区首次发现SCWL后，SCWL在云南蔗区扩展蔓延十分迅速，给云南蔗糖产业发展带来了严重灾害威胁。如得不到有效防控，可能还会给广西、广东等蔗区带来潜在的威胁。因此，对于SCWL必须给予高度的重视，并采取有效防控措施阻止其扩展蔓延，确保云南甘蔗安全生产和蔗糖产业可持续发展。由于SCWL主要通过带病蔗种进行远距离传播，建议加强对甘蔗良繁基地扩繁种苗和引进及外调甘蔗品种的SCWL的检疫和监测，严禁从发生SCWL的蔗区和田块引种和留种，同时，要加强对SCWL發病区域的检查，及时清除销毁病株，从源头上控制其扩散蔓延。另外，下一步需要深入研究SCWL的传播媒介及其传毒机理，探明甘蔗品种对SCWL的抗性，为SCWL的有效防控提供理论指导和科学依据。

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