中国自主知识产权植物转化方法研究进展

张 虎，张鹏华，崔爱民，单 皓，张久刚

（1山西省农业科学院小麦研究所，山西临汾041000；2山西省蒲县农业资源开发中心，山西蒲县041200）

0 引言

自植物基因工程诞生以来，转化方法的不断完善和创新，为更深入广泛地开展植物基因工程研究提供了便利手段。目前，世界上关于植物转基因研究的发明创新中，转基因玉米所涉及的专利有3503件，而涉及苏云金杀虫晶体蛋白的专利则多达6274件；关于转基因产品的产业化，中国和美国是种植转基因作物最早的国家，20世纪80年代，中国就开放了转基因抗病毒烟草的种植[1]。30多年来，种植转基因作物的国家数量和种植面积不断增多，截至2014年底，全球已有28个国家种植转基因作物，种植面积也由最初的179万hm2增加到1.815亿hm2[2]。据ISAAA报道，转基因植物的研究和产业化取得了巨大的经济效益、社会效益和环境效益。

在国内，转基因抗虫棉、转基因水稻、转基因玉米等的研究均取得了巨大成就，该领域研发所取得的成果数目，在世界排名为第2或第3位[3]。如国内与转基因玉米有关的专利有460多件[3]，虽比美国少，但远远高于其他国家；中国实现产业化的转基因抗虫棉品种有134个[4]，转基因番木瓜品种也基本满足国内需求；转基因水稻和玉米等也获得了农业部批准的安全证书等等。不过，这些成就与发达国家比较，还有一定的差距，主要表现在3个方面：一是专利数量少，如转基因玉米的专利美国有2388件，中国仅有460件；二是有些专利的内涵和质量不高，1991—2015年，国内申请植物转基因方法的专利288件，其中1/3经审核为无效专利；三是国内对主粮作物的产业化发展一直持观望和犹豫态度，至今没有开放转基因主粮作物的产业化[5]，而实现产业化的转基因棉花、木瓜等的种植面积，每年都在300万～400万hm2左右徘徊，转基因作物种植面积的世界排名已由前几年的第4位降到了现在的第6位[1]，形势较为严峻。造成这种局面的原因很多（后文叙述），其后果是直接影响着中国转基因技术研发和转基因产品的推广应用。

为了解国内在植物转化方法研究方面的现状和存在问题，探索其未来的发展方向和前景，为中国植物转基因研究提供理论与技术支撑。作者根据大量相关文献的报道，就基于拥有中国自主专利权的转基因方法的研究进展予以概述，提出目前还存在的一些问题，并针对这些问题给出相应的建议。

1 国内拥有自主知识产权的植物转化技术

首先，作者在“佰腾”网站[6]页面的‘佰腾专利检索’窗口中选择“中国专利库”，先后输入“转化方法”、“基因转化方法”和“基因转移方法”3个词条，分别查询到184件、99件和5件与“转化植物”有关的专利，共计288件。显然由于时间或其它原因，有些创造发明并未申请专利，如20世纪70年代末中国科学家周光宇首次提出的花粉管通道法[7]、杨剑波等[8]提出的低能离子束介导法等。

上述290件转化技术，分布年限为1978—2015年，包括目前仍然有效的有77件（包括花粉管通道法和低能离子束介导法），授权后失效的专利49件，未授权失效专利89件，公开的5件，正在实质审查的66件（见表1）。

续表1

从受理专利件数上分析，1979—2002年间每年仅受理1～4件，多数年份为0件，即便是有专利受理的年份中，多数只发生1件受理事件。2003—2010年呈不间歇上升趋势，最多2010年达到46件，随后至2015年，又呈现下降趋势，2015年仅有30件。

专利所涉及到的植物有大豆、玉米、水稻、棉花、花生、花卉、木本植物等。

从专利内容上看，绝大多数专利基本上是对现有植物转化技术的改良，申请者的目的在于保护转化的材料而不是方法本身，所以在转化研究方面大部分转化技术被应用的并不多，报道有限。故本研究多以花粉管通道法等几个重点转化方法予以讨论。

2 与专利有关的一些重大科研进展和取得的成就

2.1 转基因棉花

2.1.1 转基因棉花的研发及新品种培育 涉及棉花转化的方法，拥有国内专利保护或者国际通用的方法有7种，如周光宇的花粉管通道法、叶武威等的棉花的基因枪活体快速转化方法(CN201310046202.5)，张天真的一种农杆菌介导的不依赖于组织培养的棉花转基因方法(CN200910035360.4)、农杆菌介导法和基因枪法等，但国内应用较多的自主方法还是花粉管通道法。

最初国内学者利用激光共聚焦显微技术[9]、细胞胚胎学技术[10]等以及在各种作物上转化验证了花粉管通道法的科学性和实用性[11～15]，证明花粉管通道法适合于对所有开花作物进行遗传转化的研究[16]和种质资源的创新[17]。

在转化方面，1978年周光宇[18]和邵启全等合作进行外源DNA导入研究，在小麦、水稻、棉花上都发现有变异的子代；1983年，周光宇等[7]成功将外源海岛棉的DNA导入到陆地棉品种中，培育出抗枯萎病的棉花新品种；1992年郭三堆研究团队用人工合成方式获得了BT杀虫基因，并于1994年将这个基因转化到棉花品种，创制出了中国第一个抗虫棉，随后他们又将杀虫基因和CpTI基因导入‘石远321’、‘中棉所19’等棉花品种中，研制出双价抗虫棉[19]；1991年，中国农业科学院生物技术研究所谢道昕等与江苏农业科学院经济作物研究所黄骏麒等[20]2个课题组合作，采用花粉管通道法将Bt.aizawa7-29、Bt.kurstaki HD-12个杀虫基因分别导入无毒棉和中棉品种中，获得了转基因植株，并证明目的基因在受体中得到表达；1993年，合作组仍采用花粉管通道法将GFM Cry1A杀虫蛋白基因导入棉花，培育出转基因抗虫棉花植株，这是中国转基因抗虫棉的首个研发成果并随后实现了产业化种植，打破了发达国家对抗虫棉品种的垄断；此后大批转基因抗虫棉的研究均获得成功[21-23]；2002年，乐锦华等[24]利用花粉管通道法将含有菜豆几丁质酶基因和烟草β-1,3葡聚糖酶基因的双价载体导入‘石远321’和新疆棉品种，获得了转化植株，并培育出抗枯萎病、黄萎病的转基因抗病新品种；2004年，崔洪志[25]按照透明颤菌血红蛋白氨基酸排列序列，合成了vgbM基因，并将vgbM和GFM Cry1A Bt双价基因以花粉管通道法方式转化棉花，获得了既增产又抗虫的转基因棉花新材料，并发现在外源基因整合过程有转座子转双基因的7个株系。

此外，中国转基因棉花在抗旱[26-27]、抗病[28-29]、抗除草剂[30-31]以及品质改良[32-33]等方面的研究也取得了积极进展。

2.1.2 转基因棉花的产业化和效益 中国审定的第一个转基因抗虫棉品种是美国的‘新棉33B’[34]。1996年，国内开始种植转基因抗虫棉，但种植的抗虫棉品种95%以上为外国品种。自1998和1999年中国审定了第一批具有自主知识产权的转基因抗虫棉品种，如‘晋棉26号’，‘GK12’、‘GKZ1’和‘中棉所38’等，种植的转基因抗虫棉国内品种所占份额才逐步增加。2001年国内种植的抗虫转基因棉花的面积首次超过非转基因棉花的播种面积，2003年，国内转基因品种的播种面积超过了国外品种。2007年国内份额达到80%以上，此后一直处于垄断地位。目前中国共审定抗虫转基因棉花品种134个，1997—2008年，国内种植转基因抗虫棉的累积面积达2700多万hm2[4]，播种区域也由最初的华北、华中地区扩大到西北地区、长江流域和新疆等地区，据农业部2006年统计，山东、河南、河北、安徽等地的转基因抗虫棉就已达100%[35]。

关于转基因抗虫棉产业化所产生的效益，概括如下。

1999年双价转基因抗虫棉中国北部9省区的推广，由于种植转基因棉花单产增加9.6%[36]，农药用量节省75%～80%[1]，每个农户增加1500元/hm2的收入[37]；还有报道认为种植抗虫棉的棉农每公顷土地增收就高达3000元以上[38]；据分析统计[39]，在2000年因种植转基因抗虫棉棉农从中总获利7.7亿元；1996—2012年中国农民种植转基因棉花累积获利153亿美元[40]。全球统计每多种植1 hm2转Bt棉花，农民就可增收250美元[41]，国内外数据基本持平。除经济效益外，由于减少农药用量，种植抗虫棉还减少了环境污染和保护了生态多样性[42]。

2.2 转基因番木瓜

2009年国内种植番木瓜面积超过11万hm2，产值约在17亿元左右[43]。不过，在20世纪80年代，由于番木瓜遭受到番木瓜环斑病毒PRSV的侵染，导致大面积的番木瓜植株坏死，直接威胁着番木瓜产业的发展。

2.2.1 转基因番木瓜的研究及抗病品种培育 现有专利中涉及转基因番木瓜的不多，主要是功能基因保护权和转基因新品种保护权，转化方法基本上没有申请专利权保护，但也有几个国内独创但未申请专利的番木瓜转化方法，如花粉管通道法、体胚发生途径转化法、胚状体振动共培养转化法、愈伤组织与农杆菌共培养转化法等，下面分别予以叙述。

1991年，叶长明等[44]构建了番木瓜环斑病毒外壳蛋白Ys-CP基因，并随后采用体胚发生途径转化番木瓜，得到2株转基因植株；1995年，周鹏等[45]以胚状体振动共培养法将PRSV-Nib基因转入番木瓜子叶型胚状体，获得了转基因植株，并在1996年[46]的试验中证明，PRSV-CP-SN转基因植株比PRSV-CP具更强的田间抗病性，即转双价基因效果更好；1998年，陈谷等[47]将课题组构建的PRV-RP基因植物表达载体，采用愈伤组织与农杆菌共培养的方法转化番木瓜‘台农2号’，获得了转基因植株，同年，赵志英等[48]采用农杆菌介导法将PRV RNA核酶基因导入番木瓜，获得转基因抗病毒病番木瓜植株，进一步地观察发现，转基因番木瓜比非转基因番木瓜只是推迟了发病期，一般为推迟3～5周发病；2003年，叶长明等[49]在研究转基因番木瓜的抗病性时发现，转基因T1及T2转番木瓜2个品系对PRSV达到高抗，证明目的基因能够稳定遗传，同时发现转化复制酶基因的转化体抗病谱窄，培育的新品种因受到地域限制而不易推广。2004年，阮晓蕾等[50]的试验得出同样的结论。2005年，饶雪琴等[51]利用PCR重叠延伸技术，将PRSV-Vb株系的外壳蛋白基因和Ys株系的复制酶基因构建成融合基因VY，结果就是获得对PRSV广谱抗性的转基因番木瓜；同年，冯黎霞等[52]对转番木瓜环斑病毒复制酶Trp基因的第3、第4代植株进行攻毒试验，发现这些转基因植株绝大部分对PRSV都高抗，但在1个38株品系中有3株发病；2008年，魏军亚等[53]利用花粉管通道法将番木瓜环斑病毒外壳蛋白(PRSV-CP)基因3’-端同源序列dsRNA导入番木瓜‘蔬罗I号’子房中，获得转化植株，田间抗病鉴定结果证明，转基因植株对番木瓜环斑病毒(PRSV)具有不同程度的抗性，大部分材料表现推迟发病。2009年，蔡群芳等[54]将番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV_CP)278 bp片段以花粉管通道法转入番木瓜‘soloII’，获得了阳性率高达50%以上的植株，有待对抗病毒性能做进一步鉴定。

有关转基因番木瓜的食用安全性，阮晓蕾等[55]应用气相色谱分析技术研究发现，转基因番木瓜与非转基因番木瓜中苄基异硫氰酯含量没有变化，即转基因并没有导致苄基异硫氰酯在转化植株内增加，因而判断转基因番木瓜不可能引起食用者的过敏反应；在转化番木瓜过程中，经常会用到一个标记基因——卡那霉素抗性(NPTII)基因，食用转基因番木瓜者担心过多食用会产生抗生素耐性，对此，贾士荣[56]通过对研究资料的大量分析认为，卡那霉素抗性基因在转化体内是安全的；此外由于转基因番木瓜的抗病性提高，节省了农药的使用量，因而果实中农药残留量也自然会降低[57]。国内近10年的转基因番木瓜产业化过程中，并未发现食用者有不良反应的事例。所以，转基因番木瓜的食用是安全的。

2.2.2 转基因番木瓜的产业化及效益分析 在转基因番木瓜新品种培育方面，华南农业大学创制的高抗病毒病的转基因品系‘华农1号’，在2006年取得农业部安全证书，获准在生产上推广应用[50]，随后转基因抗病番木瓜的种植面积由最初的数百公顷，发展到2015年的10000 hm2[58]，种植区域遍布中南沿海地区。

转基因番木瓜的产业化的贡献如下：①经济效益明显，种植番木瓜的年产值为84000元/hm2左右，扣除成本后，每公顷纯收入约为57000元[59]，因而深受果农欢迎；②中国目前仍然是转基因番木瓜和非转基因番木瓜混种局面，转基因番木瓜的产业化，使得人们可以利用有限的土地，保证非转基因番木瓜的轮作倒插和种植面积，间接增加了中国番木瓜的种植面积；③转基因番木瓜产业化有利于保护和增加现有番木瓜品种数量，避免番木瓜产业的毁灭；④转基因抗病毒病番木瓜的种植，减少了农药使用量，有利于保护环境免受污染，维护生态多样性；⑤满足市场供应，为消费者提供物美价廉、食用安全的新鲜水果。

2.3 转基因水稻

目前，国内转基因技术在水稻上的应用研究处于世界领先地位，催生了一大批抗虫、抗除草剂及品质改良的水稻新品系和材料[60]。

从发现外源DNA导入水稻后，后代有变异植株[18,61-62]；到筛选培育出一批转基因抗虫[63-65]、抗病[66-69]、抗除草剂[70]和品质改良[71-73]的水稻材料，中国科学家利用自主的转化方法进行了不懈的努力。张启发院士研发团队将中国科学家人工改造合成的苏云金杆菌杀虫蛋白融合基因Cry1Ac/Cry1Ab转化到水稻优良品种‘明恢63’中，经选育获得了转基因抗虫优良品种‘华恢1号’；随后又以‘华恢1号’为父本，‘珍汕97A’为母本，通过杂交选育得到转基因抗虫品种‘Bt汕优63’。转基因抗虫水稻具有抗水稻二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等水稻鳞翅目害虫的优点。这2个水稻品种于2009年首次获得农业部安全证书，但一直没有大规模产业化种植，只是允许在湖北试种。不过，2015年农业部再次对这2个品种发放安全证书，可以预见，其实现产业化为期不远。

转基因水稻产业化效益。目前，转基因水稻在国内尚未实现产业化，但一些优良转化新品系的试种数据可部分反映出种植转基因水稻的效益。2005年，张启发[74]总结了国内试种试验，结果表明，种植转基因抗虫水稻，单位增产幅度高达12%，增收幅度为900～1200元/hm2；2009年，谭涛等[39]进一步对中国在安徽宣州和湖北荆州所做的转基因水稻试种试验作了总结，发现转基因水稻增产增收效果不大，但转基因水稻的种植减少了农药用量，有利于环境保护；2010年，黄季焜等[75]在《转基因生物技术的经济影响》一书中提到，种植转基因抗虫水稻，农民平均每公顷可节省投入600～1200元，其中可节省80%的农药投入、9个工作日用工，还可显著减少因受虫害造成的水稻产量损失，由此可使水稻增产6%～9%。可见，种植转基因抗虫水稻是利大于弊，既能增产增收，又能减少环境污染。

2.4 转基因玉米

国内转基因玉米的研究起步于20世纪90年代。现有申请自主知识产权的玉米转化方法专利18件，但应用较多的转化方法是花粉管通道法和花粉介导法。利用这些方法，国内先后筛选创制出转基因抗虫[76-78]、抗除草剂[79-81]、抗病[82-84]、抗逆[85]和品质改良[86-88]的玉米材料。

中国农业科学院生物技术研究所范云六院士科研团队将来源于黑曲霉并人工修饰的植酸酶基因phyA2通过基因枪共培养法转化至玉米，获得了转基因植株，转化体能够高效表达植酸酶，表达量是野生型菌株的30倍，有利于提高无机磷的利用效率。此成果2009年和2015年2次获得农业部批准的安全证书，为中国实行转基因玉米产业化奠定了基础

转基因玉米产业化的效益。因为国内并未开放转基因玉米的产业化种植，所以可借鉴国外种植转基因玉米的成就展示转基因玉米产业化的未来。

以美国为例，1996年种植转基因玉米20万hm2，1997年为200万hm2，1998年为1000万hm2，1999年为1200万hm2，据报道种植抗虫转基因玉米可增产5%～10%[89]；在种植转基因抗虫玉米之前，美国每年约有3200万hm2玉米田受到玉米螟、棉铃虫等的危害，并因此使玉米产业每年损失10亿美元。种植转基因Bt抗虫玉米后，仅产量提高一项（提高9%），每公顷转基因玉米田就增收148美元；常规玉米田每公顷要使用农药化肥54.36美元，种植转基因玉米后每公顷仅用25.01美元，转基因Bt玉米的种植将抗虫用品减少了34%，减少总量高达7090 t，表现出良好的环境效益[90]。

以菲律宾为例，李海英等[91]对菲律宾种植转基因玉米的情况的调研发现，菲律宾2003年种植转基因玉米大于1万hm2，2011年超过了68万hm2，就菲律宾玉米单产而言，1993年仅有1.52 t/hm2，2002年为1.8 t/hm2，2003 年1.92 t/hm2，2011 年达 2.74 t/hm2。玉米单产的提高与同期转基因玉米种植面积所占国内玉米总面积比重的提高有关，单产增加与转基因玉米推广面积比重间的相关系数达0.98。

2.5 其他

有关转基因大豆、小麦、油菜、林果木等，其转化方法涉及的国内专利共有80多件。如：一种大豆组织培养和遗传转化方法(CN201310291640.8)、一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法及其应用(CN201110141799.2)、桑树花粉介导转基因方法(CN201110377215.1)、植物悬浮培养物高效转化和再生的方法(CN200480042792.3)等。但这些专利中，仍以花粉管通道法和花粉介导法应用较为广泛。

花粉介导法最初是在玉米材料上使用取得了成功。后来，科学家把这种方法应用于不同作物（植物），并先后在谷子[92]、花生[93]、油菜[94-95]、野罂粟[96-97]、黄花梨[98]、高粱[99]等作物上成功获得了转化植株。

除2.1～2.4中作物外，花粉管通道法还在小麦[100]、大豆[101]、紫苜蓿[102]、高粱[103]、裸燕麦[104]等作物上得到转化植株。

此外，这些方法在黄瓜、韭菜、番茄、马铃薯、甘薯、花卉植株、其他果木等植物上也有很多转化成功的报道。

3 展望

3.1 存在的问题

中国的植物转基因研究水平虽在该高技术领域还占有一席之地。但与发达国家比较，确有较大差距。具体表现在如下3个方面：①拥有自主知识产权的专利数目较少：单美玉等[3]曾以转基因玉米所涉专利为例，全球专利件数3503件，按各国拥有的专利件数排队，前4位依次为美国、中国、德国和瑞士，但从各国专利数目绝对值来看，美国2388件，中国460件，德国170件，瑞士70件。排在第2的中国专利数只占美国专利数的19.3%。涉及苏云金杀虫晶体蛋白的专利，全球共有6274件专利，国外5家公司拥有数量就占70%以上，涉及EPSPS基因的专利有1327项，这5家公司约占63.4%。就转基因品种专利而言，仅美国孟山都一个公司就控制全球一半以上的转基因抗虫品种和约70%的抗草甘膦品种[105]；②专利内涵不多，质量不高，致使相当一部分申请的专利（约占总申请数量的1/3）因未通过审核而失效；③国内转基因作物产业化步伐缓慢。

造成上述局面的原因大致可归纳为：①研发团队间缺少协调与配合，承担科研任务的单位间由于缺少统一的管理措施和监督体系，又缺乏自发的相互协调和配合，使得一些研究项目多次重复或缺少，结果一些领域研究不够，一些领域重复劳动，出现相当数量的类似或相同的结果或成果，表现在专利申请层面也是如此。②产学研配合不力，企业拥有资金和产品产业化研发较深入的优势，学校和科研单位的重点是新产品的开发，但缺少经费，两者联合，可弥补各自的劣势，科研经费得到保证，科研成果又可尽快转化为生产力，反过来，企业也会因成果转化而获利。③经费来源少、数量有限：经费主要来源于国家资助，企业投入很少，甚至没有。大多科研单位的经费仅能够维持简单的日常科研工作，缺少用于攻关、创新的科研经费，结果只能是科研成果多而不精，④政策保护和鼓励不力，由于保护和鼓励科研成果转化的政策还不完善、科研人员待遇偏低、社会上反转舆论高涨等，从事植物转基因研究的科研人员社会地位受到影响，工作积极性和主动性受到伤害，直接影响到该领域科研工作的更快发展。⑤转基因产品产业化步伐缓慢，仍未开放转基因主粮作物的产业化，使许多研究成果无法应用于生产，因而也得不到社会认可，从事转基因研究的科研人员压力较大。

3.2 建议及对策

上述问题的存在，对国家的科技发展战略会产生消极影响，关乎中国科研事业的持续、有效和健康发展，所以必须给予高度重视。对于这些问题的解决，作者提出如下几点粗浅的参考意见：

（1）健全和完善相关政策及制度。国家应该完善与植物转基因科研管理和监督有关的政策制度，管理制度应符合国情，还应具备可操作性，尽量为科研工作创造一个和谐、宽松的环境，而不是事无巨细，让科研人员忙于应付各种检查或审计；监督方面，首先是建立完备的监督体系，二是应明确监督者责任，监督失察应承担渎职责任，这样方能使监督工作落到实处。

（2）构建攻关团队，集中精力和财力攻关创新。目前中国的转基因重大专项等项目的实施方案就是通过指定或选拔学科带头人主持项目，主持人从中央到地方各级科研单位中筛选符合项目条件的科研人员参加项目的具体实施。其优点一是由各精英组成的团队具备1+1＞2的工作能力和创新能力，二是财力较为集中，为科研创新准备了经济条件，三是避免了重复劳动，节省了人力、财力；四是强大团结的科研团队具有一定的竞争实力，可以使中国科研团队通过各种组合或结合，参与国际竞争，确保国内科学研究水平立足于世界先进国家的前列，甚至是领头羊。

（3）产学研联合，协力创新。在国内，学校和科研单位主要负责对新品种、新技术的研发，种业企业主要负责新品种推广应用等，同属产业链中的重要组成部分。三者联合的形势可以是：a.可以互派科研人员，针对要解决的问题进行切实的合作研发，经费各自负责；b.科研人员可以合理流动，选择自己认为能够发挥特长的专业开展工作；c.企业与学校和科研单位合作，向学校或科研单位提供研发经费。产学研联合的优势：①可以缓解科研经费紧张的局面，有更多的经费进行科技研发和创新；②借鉴相互的优势和相互督促，加速科研和开发进程，使科研成果能够及时转化成生产力，企业得实惠，科研有经费，实现互赢局面；③研发和开发的目标明确，符合生产需求，避免人力、物力和财力的浪费；④增强各自实力，有利于在国际竞争中立于不败之地，甚至是优势地位；⑤产学研联合可使产业链更加合理、快速运转，提升中国产业持续发展的能力和潜力。

（4）建立科研成果共享平台。平台的建立实质上是为大家提供各种信息，成果是项目研究的结果，根据成果种类与多少，可以了解在哪些领域可以继续研发或在什么深度上开始研发。让科研工作者做到有的放矢。

（5）广泛开展植物转基因知识的科普宣传，让民众认识、了解转基因技术及其产品，并最终接受它。在排除舆论对相关研究的干扰的基础上，加快实现中国转基因植物的产业化。

纵观全局，中国植物转基因研究在困难曲折中取得较大进展，在世界上生物技术研究领域占有一席之地，为进一步更深入广泛地开展植物转化研发和实现其产业化奠定了一定基础。植物转基因研究和产业化不仅只是技术问题，也是中国农、林业发展和国家粮食安全保障的强有力后盾。因此进一步开展植物转基因研究，并逐步实现其产业化是大势所趋。展望未来，中国的植物转基因研发任务极为艰巨，但却有着广阔的发展前景。