microRNA在水稻抗逆性状中的研究进展

张子怡

（仲恺农业工程学院，广州 510000）

0 引言

随着人口的日益增长，食物需求量不断上升。据推测，到2030年，世界人口将增至80亿，粮食需求量增加60%，然而现代工业的发展导致空气水土污染逐年增加，全球气候变暖，良田减少，自然灾害频发，中国农作物面临越来越多的不良环境条件。水稻是重要的粮食作物，据推测，到2025 年水稻的总产量必须是现有的2倍才能满足人口的需求，但20世纪以来，水稻产量的增长水平一直处于徘徊不前的境地。MicroRNA（微小RNA）是20世纪才被人们发现的基因调控因子，有关其的研究也是日益增多，探明微小RNA在生物体内调控生物生理行为的机理并将其合理运用以达到对人类有用的目的是近几年的研究热点。同样，在水稻抗逆性状的研究上也应重点关注miRNA 对水稻所产生的影响。目前有关miRNA 在水稻抗逆性中起到的作用研究成果还不多，综述更是少之又少，这与其研究的难度有关，但从现有的研究成果中不难看出miRNA在水稻抗逆性中起到的作用非常显著，可见在未来这一领域必将是热点与重点，故现作此研究进展综述，希望对未来miRNA 在水稻抗逆性方面的运用研究有一定的帮助。

1 microRNA在植物中的应用研究

成熟的microRNA是一类细胞内普遍存在的长度约为22个核苷酸的微小RNA，简称miRNA，其通过形成miRISC（miRNA 诱导沉默复合物），并与靶mRNA结合进而使靶mRNA 降解或是抑制靶mRNA 的翻译的原理，达到调控相应抗逆性相关基因的目的。

1990 年Napoli 等在一次意外的矮牵牛花实验首次发现了转录后沉默现象，而1993 年Ambros 等在秀丽线虫实验中通过对比2 个突变体的非编码RNA 编码情况，更加明确了转录后沉默的原理，这一系列突破性发现使人们的视线聚焦于miRNA 在生物机理中怎样以及如何起作用上，开辟了基因表达调控的新研究方向[1]。而植物miRNA 的研究起步要比动物晚，2002年才首次在拟南芥中克隆到miRNA，由此开始了对植物miRNA的大量研究，种种研究结果表明：miRNA在植物生长发育（如叶形态发生、花的分化和发育、根的分化和发育等）、细胞周期调控、基因表达及抗逆性方面起到极为关键的重要作用。

影响作物的生长因素有土壤、温度、湿度、水质、盐碱等，根据Levitt的分类，非生物胁迫主要分为温度胁迫、矿物胁迫和水分胁迫3 类，其中，温度胁迫细分为低温危害与高温危害，矿物胁迫主要有盐害、铝害、重金属危害、缺铁、缺磷等，水分胁迫细分为干旱与渍害。

非生物胁迫下植物细胞能够形成一些胁迫蛋白来抵抗逆境，如低温胁迫下合成抗冻蛋白，通过抑制冰晶生长从而减轻冰晶对类囊体的伤害，又如高温胁迫下合成热激蛋白以提高抗热性等。面对逆境胁迫，不仅只有胁迫蛋白在植物体内发挥作用，调节渗透机制也是提高抗逆性的一大手段[2]。大量实验表明[3-7]，低温、高温、干旱、洪涝、盐碱等不良条件下，逆境会诱导参与渗透相关基因的表达，形成一些可提高细胞溶质浓度的物质如氨基酸、有机酸、无机离子等，使植物能从外界持续获取水分。人们继而发现了无论在何种逆境条件下，植物体内的脱落酸含量都会增加，如面对10℃以下的低温，水稻幼苗叶片和黄瓜子叶的脱落酸含量明显增加，因此认为脱落酸是一种胁迫激素，即应激激素，它在植物抗逆原理中发挥了极大作用[8-9]。Wei等[10]利用miRNA 芯片对干旱胁迫下13 个物种的miRNA的表达情况进行了对比分析，发现了只有含有脱落酸的miRNA靶基因才会对干旱胁迫做出反应，如miR167、miR168、miR528 在干旱条件下表达下调，从而导致其各自的靶基因（磷脂酶D，促分裂原活化蛋白激酶，过氧化物酶）表达上调，进而导致植物叶片气孔关闭以及多种抗氧化系统活性的增加，最终提高了对干旱的抵抗能力。

据研究[11-15]，植物机体内已自然进化出一系列应对非生物胁迫的机制，而miRNA在这些机制中起到关键作用，对胁迫敏感的miRNA可能通过应激反应控制靶基因的表达，而最新研究表明植物抗逆性与抗逆性相关基因及其启动子在碱基序列上的GC含量有一定关系，含量越高则基因稳定性越高，抗逆性越强[16]。

2 mircoRNA在水稻抗逆性中的应用研究

2.1 抗旱

在所有谷类作物中，水稻对干旱因素最为敏感，尤其在生长期时，即使是温和的干旱胁迫，也会导致不同程度的不育和减产。据统计，每年栽培水稻的用水量占每年农业总用水量的70%，在水资源日益匮乏的现状下，具有干旱抗性的水稻品种越来越受人们欢迎。

研究表明，miRNA 家族中的不同miRNA 功能并不完全一样，例如在水稻体内的miR169 家族中仅有miR169g 是在水稻抗旱胁迫中起作用的，且不同植物体内的miRNA 面对逆境胁迫时采取的对应措施也不一定相同，如拟南芥体内的miR169 家族中，miR169a和miR169c 的调节方式刚好与水稻相反，干旱会抑制它们的表达，却提高了拟南芥的抗旱性[17]。

miR393 是很多植物在抵抗干旱胁迫中起重要作用的miRNA，miR393通过对靶基因TIR1（转运抑制剂反应蛋白1）进行调控使介导的生长素信号受到抑制而达到抗旱目的。

Zhou 等[18]于2010 年利用芯片扫描首次发现了19个新的在水稻抗旱性中发挥作用的miRNA，其中11个为上调表达，分别是miR170、miR172、miR397、miR408、miR529、miR896、miR1030、miR1035、miR1050、miR1088、miR1126；8个为下调表达，分别为miR395、miR474、miR845、miR851、miR854、miR903、miR901、miR1125。同时，Zhou 发现，ptc-miR474 与ath-miR854a 家族均在干旱胁迫下表现出严格的上调表达，ath-miR170 和ath-miR396 家族则表现为严格下调表达[19]。Sun 等于2017 年用DK151 和IR64 作为实验对象，发现在干旱胁迫下DK151 产量明显高于IR64，DK151体内响应干旱逆境的已知miRNA数量相较于IR64 高出265 个，Sun 等通过荧光定量PCR 技术预测了其中12个miRNA对应的220个靶基因，但只有miR1425-5p、miR1861b、miR1861h、miR1490、miR396e-5p、miR398p 和miR5521 这8 个miRNA 检测到了剪切片段，同时他们也发现降低一些miRNA的表达可能会导致一些受干旱诱导而发生调控的转录因子表达呈上升或下降趋势，这将导致一些其他的非生物胁迫响应能力上升或下降。

2.2 抗冷害

水稻喜高温，种子发芽最低温度8℃～14℃，最适30～35℃，最高38～42℃。分蘖期日均20℃以上,穗分化适温30℃左右；低温会使枝梗和颖花分化延长，抽穗适温25～35℃，开花最适温30℃左右，低于20℃或高于40℃时，授粉会受严重影响，可见水稻对低温抗性不高，故培育抗冷害的水稻品种能有效降低环境温度对水稻生长的阻碍作用，使种植难度降低，可播种时间扩宽，进而增加产量，提高质量。

截至目前的研究，水稻中对冷害胁迫起响应的miRNA 主要有24 种，分别为miR157、miR159、miR160、miR162、miR164、miR166、miR167、miR169、miR172、miR319、miR393、miR395、miR396、miR397、miR398、miR408、miR446、miR528、miR530、miR535、miR812、miR814、miR1425和miR1436[20-23]。

根据报道出来的文献，拟南芥中miR167 与miR319面对冷害胁迫时均上调表达，而在水稻幼苗体内却是上调表达，待miRNAs成熟后再表现下调[24]。

从real-time PCR 的测试分析可得出，osa-miR393基因在水稻受到冷胁迫之后有持续表达上调的趋势，而osa-miR396c 基因的表达趋势是先上调再回落的，虽然2 个基因在冷胁迫后的表达模式不同，且表达量与实验对照组差距不大，但总的来说这2 个基因是能响应冷胁迫的，推测原因可能有2点：一是实验中冷胁迫处理时间长短未能达到要求，二是由于一个RISC复合体可以和多个靶mRNA结合并完成剪切过程，故无需miRNA 表达量很大即可达到使靶基因表达发生变化的目的[25]。

Jeong 等[26]发现了miR1425 在水稻面对冷害胁迫时会下调表达来调节RF-1（生育恢复基因）的表达，从而提高水稻耐冷性。

2.3 抗盐

在全球范围内，土壤盐化都存在逐渐加剧的问题，中国约有2000 万km2的盐碱地，大约占耕地面积的10%，如能提高现有作物的耐盐能力或是开发出耐盐新品种，那必然会大幅度减轻当前粮食短缺的程度。盐胁迫会影响到植物几乎所有的生命进程，尽管植物先天拥有一些耐盐的能力，但是盐胁迫仍然会造成作物产量大幅下降以及质量不达标。因此研究植物的耐盐机制、开发利用耐盐植物资源有着重要的意义。

植物抗盐实际就是在盐浓度远高于正常生长环境下的盐浓度这一条件下，如何保证自身仍能获取足够的水分与养分，以到达正常新陈代谢与生长发育的需求。不同种类的植物抗盐方式和抗盐程度不同，同一植物的不同生育期抗盐能力也不同，耐盐范围在1.5%～2.0%的称为盐生植物，而耐盐范围仅在0.2%～0.8%表达的则是甜土植物，水稻就是典型的甜土植物。面对盐胁迫植物采取的应对措施有避盐和耐盐2 种，避盐即减少体内积累的盐分，如柽柳属会通过茎叶表面的盐腺排出体内多余的盐分，耐盐则是通过生理机制如改变渗透调节和加强新陈代谢等忍受进入细胞的盐分。近年来人们研究发现，NaCl 胁迫会诱导H+-ATPase基因表达以达到水解ATP排出H+的目的，使质膜上的Na+/H+反向运输器利用跨膜H+浓度将Na+排出细胞再将H+重新运输回来[27]。

研究证明miRNA 是通过调控与耐盐性相关的基因这一途径来间接参与植物耐盐响应的。miR397 可作用于LACs和CKB3等相关抗盐蛋白使其下调表达，从而提高植物耐盐性。miR393 作用于靶基因TIR1，间接调控耐盐相关基因P5CDH和SR05的表达以达到明显增强植物耐盐性的目的。Jung 和Kang 研究发现miR417的下调表达会降低植物幼苗生存率，进一步的实验证明其与盐胁迫对抗也密切相关。Zhu等[16]通过高通量测序技术发现水稻幼苗在盐胁迫条件下体内共有85 个内含子miRNAs 表达，其中差异表达的有24个。最新研究证明了in-miRNAs与宿主基因的转录加工表达相关度并不高，这意味着部分miRNAs 可能有着相对独立的一套基因表达原理，Chun 等[28]利用RTPCR 技术验证了水稻中的miR-3026、miR3028 和mi-R3029 就可能具有独立启动子。Dong 等于2016 年克隆了水稻内含子miRNA-3026的启动子。

根据目前的研究，水稻miRNA中参与耐盐性调控的有miR156、miR159、miR160、miR162、miR164、miR165、miR167、miR169、miR171、miR319、miR393、miR395、miR396、miR397、miR398、miR530、miR1436、miR1848，随着盐胁迫处理的时间增加，水稻中的miR156、miR164、miR167、miR169、miR171 在根部表达量增加，miR159、miR160、miR319、miR398、miR1484 先减少后增加。而能确定的水稻miRNA 对盐胁迫应对的机理有：miR156 作用于靶基因SPL 与SPB，miR159 作用于靶基因MYB，miR160 和miR167作用于靶基因ARF，miR162 作用于靶基因P450，miR164作用于靶基因NAC，miR165和miR530作用于靶基因HD-ZIP，miR169作用于靶基因NF-YA，miR171作用于靶基因SCC，miR319 作用于靶基因MYB，miR393 作用于靶基因TIR1、E3 泛素连接酶、F-box 蛋白，miR395作用于靶基因APS，miR396作用于靶基因GRL，miR397 作用于靶基因Laccase，miR398 作用于靶基因CSD，miR1436作用于靶基因WRKY[29-31]。

2.4 缺营养元素及抗重金属危害等

植物作为地球上生命主要形态之一，相对于动物而言，无法选择生存环境，并且不易移动，故其所处的周围环境对其生长发育影响比较大。土壤中的铁、氮、硫、磷、钾等元素是参与水稻生长发育的重要营养物质，然而自然界所提供的营养元素量有限，故通过人工调节水稻面临缺营养元素时的反映机制有利于提高水稻的产量与质量，通过miRNA简介调控水稻体内参与营养运输的蛋白质表达量是一个有效方法。而土壤中的微量元素也有很多会对水稻幼苗的生长造成抑制，如铜、镉等，故通过miRNA 调节水稻体内胁迫蛋白的表达也有助于提高水稻的抗重金属胁迫能力[32]。

研究表明，植物在面对缺磷条件下，体内的miR395、miR399、miR398、miR827 均会做出反应，水稻体内的AtPHR1 的同源基因OsPHR2 被认为是缺磷胁迫下调节miR399 表达的重要调控因子，根据05 年Fujii 等[33]的研究，miR399 是通过下调表达抑制了PHO2 的表达以此来调控磷元素在水稻根部的运输。有报道显示，水稻D3 同源基因MAX2 能在磷胁迫条件下做出响应。Yang 等的研究显示，水稻中miR528潜在靶mRNA很多，Yang通过5'RLM-RACE在日本晴水稻中验证得到miR528对OsAO和D3的调控作用。

Bartel[34]、Jeong等[35]的实验结果表明，miR395在水稻和拟南芥面临低硫胁迫时会下调表达，这是由于转录因子SLIM1的调控作用，miR395能够调节硫转运体基因以及硫代谢相关基因APS1、APS3 和APS4 的表达。另有研究表明，尽管miR395和硫转运体基因在拟南芥根中的表达都受缺硫诱导，但它们被诱导表达的细胞定位并不同，miR395主要在韧皮部薄壁细胞中被诱导，而硫转运体基因的表达主要在木质部薄壁细胞中被诱导。但是目前为止更精确的miR395 表达模式还未被解释清楚。

水稻在面对低氮环境时有63 个保守miRNAs，26个新miRNAs 具有表达差异，表明这些调控miRNAs可能与水稻应对低氮胁迫有关，但目前对这些共调控miRNA 的功能尚不清楚。值得注意的是，miR169 经常被报道出与植物的抗低氮有关，拟南芥中面对低氮胁迫时会抑制miR169的表达，从而调节靶基因NFYA家族转录因子的表达。同时也有报道说miR169 和NFYA 基因与干旱胁迫有关，可能表明在低氮环境下植物的耐旱性会有所提高[36]。

植物面对Cu胁迫时miR398会诱导超氧化物歧化酶SOD增加表达量以合成更多的Cu/Zn-SOD酶，从而达到提高Cu抗性的目的。而在少Cu条件下，miR398却会上调表达使CSD1 和CSD2 减少，故适量的Cu 其实有益于植物生长[37-40]。朱子亮等[25]指出植物面对镉胁迫时miR171 和miR393 率先做出反应，而不同植物面对重金属胁迫时率先做出反应miRNA种类也不同，如在蒺藜苜蓿应对重金属胁迫中做出反应的miRNA有miR171、miR319、miR393、miR529，且均表达上调。实验证明，与水稻应对镉胁迫密切相关的miRNA主要有miR165 家族，miR171a、miR171b、miR408 家族、miR604、miR2122、miR528、miR397b、miR167j、miR1856、miR398a和miR5808等。

水稻是重要的模式作物，自完成了基因组测序后，研究miRNAs对水稻抗重金属危害的作用于机理成为可能，但目前对于水稻体内特定的抗重金属相关miRNAs的种类与功能的研究取得的成果较少[41-43]，因此参考文献也较少，可见未来在这一方面应会有更大更重要的突破。

3 展望

原来QTL 的研究大多集中在孤立的蛋白质编码基因上，很明显现在还需考虑转录后调控的非编码RNA，如miRNA，越来越多的研究表明miRNA是在研究作物抗逆机制中应当重点关注的QTL，并且合理运用它可以很大程度地提高作物抗逆性，降低环境对作物的影响和种植难度，提高作物产量与质量[44]。

MiRNA作为较晚被发现的一种基因调控手段，是时下的研究热点，而miRNA在水稻抗逆性中的应用近几年在国内也是如火如荼地展开，虽说在一些方面取得了比较成功的研究成果，但相较于其他提高水稻抗逆性手段的研究阶段来说，其还处于刚起步的阶段，笔者总结了目前存在的问题及其对应的解决方法：（1）很多水稻特异的miRNA种类尚未被发现。MiRNA总数十分庞大，约占总基因的1%，要解决这一问题，研发高效快速的检测、测序、分析技术（例如CRISPR 敲除miRNA 或其靶位点）十分重要[45-48]。（2）对于已发现的miRNAs中还有很多尚未清楚其功能或是其对应的靶基因，解决此问题需要科研工作者的努力。（3）对于已经探明靶基因和其所负责的功能的miRNA，要找寻运用它的方法，切实有效地将它运用于生产中。