镰刀菌胁迫培养后对土壤熏蒸剂的敏感性评价

黄邦成，杨进成，顾凡，杨童雨，张钟，余代宏，杨美芳，李铷，汤东生

（1云南农业大学植物保护学院，昆明 650201；2玉溪市农业科学院，云南玉溪 653100；3云南元江县植保站，云南元江 653300）

0 引言

镰刀菌(Fusarium)是一种世界性分布的真菌，无性时期属于半知菌亚门，有性时期为子囊菌亚门，不仅能在土壤中越冬越夏，还可以引起多种土传病害的发生，常见的有枯萎病、猝倒病、立枯病、疫病、根腐病、青枯病、根结线虫病、软腐病、菌核病等[1]，由镰刀菌侵染引起大豆镰刀菌根腐病是一种分布广、危害重、且难以防治的世界性土传病害，广泛分布于世界各大豆产区，目前该病已经对中国的大豆生产造成严重危害[2]。由镰刀菌侵染引起的香蕉枯萎病已在世界各地大面积发生，被喻为香蕉的“癌症”，一旦发生无药可治，造成了严重的经济损失[3]。镰刀菌能在土壤中存活多年，一旦有适合的时机就会侵入寄主植物，因而均有很强的传染性和隐蔽性，目前很难在农业生产上进行有效地防控，而土壤消毒是目前防治由镰刀菌等引起的土传病害较为有效的措施之一[4]。

土壤熏蒸剂一般在作物种植之前进行施用。按熏蒸剂在常温下的物理状态，可以分为气态熏蒸剂、液态熏蒸剂和固态熏蒸剂3 种类型，熏蒸前灌溉可有效降低通过注射方式施入土壤的熏蒸剂的散失[5]。利用熏蒸剂处理土壤能不同程度地防治作物土传病害的发生，有利于作物的生长，提高作物的产量，并且影响土壤中微生物数量的变化（在整个处理期内，细菌和放线菌的数量大多呈先抑制后激活状态，而真菌大多表现为长期抑制状态）[6]。在土壤熏蒸剂中效果最好且应用最广的溴甲烷能防治多种细菌、真菌、线虫引起的病虫害[7]，但是相关科学家们研究发现溴甲烷是一种消耗臭氧层物质(ODS)，长期使用会破坏大气中的臭氧层，从而形成“臭氧空洞”[8]，2015 年1 月1 日中国全面禁止溴甲烷在农业行业中使用。氯化苦熏蒸土壤可杀灭土壤微生物，对细菌（芽胞杆菌除外）、放线菌、真菌的杀灭率均在85%以上，有效地减少土传病害病原菌的数量，从而降低土传病害的侵染率[9]。1,3-二氯丙烯被用作一种优良的杀线虫剂，同时对一些地下害虫有效，但对一些杂草和病原真菌的抑制作用有限[10-13]。将1,3-二氯丙烯与氯化苦混用后可以拓宽其防治效果，氯化苦加1,3-二氯丙烯的混剂已在国外很多国家得到了广泛应用，对镰刀菌、黄萎病菌和杂草都有良好的防效[14]。

目前，土壤熏蒸剂在病虫害防控中存在效果不稳定，持效期短的问题[15]。笔者猜测不同的环境因子胁迫下，病原菌对熏蒸剂的抵抗能力不同，从而影响了熏蒸效果。因此，笔者先对病原菌进行胁迫处理（pH、盐胁迫、温度），然后再熏蒸，再接种后正常培养，以此揭示胁迫处理后对熏蒸效果是否产生影响，以期为田间熏蒸提供更好的方案，从而提高熏蒸效果。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

室内试验于2017年3月在云南农业大学植物保护学院2楼杂草实验室进行。

1.2 试验材料

1.2.1 供试药剂与菌株

（1）供试药剂。30%氯化苦乳油，山东圣泰农业开发有限公司；30%1,3-二氯丙烯油悬浮剂，山东圣泰农业开发有限公司；50%氰氨化钙颗粒剂，宁夏大荣化工冶金有限公司。

（2）供试菌株。由云南农业大学杂草实验室保存的镰刀菌株(Fusarium oxysporumf.sp.)。

1.2.2 供试培养基PDA 培养基：葡萄糖20 g，马铃薯200 g，琼脂16 g，用纯水定容到1000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 不同浓度的药剂制备将3种熏蒸剂加水分别稀释到500倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍，制成不同稀释倍数的熏蒸剂。

1.3.2 3种熏蒸剂对镰刀菌的毒力测定将上述配制好的药剂倒入自制简易干燥器中180 mL（约1/4），取直径为1 cm 的打孔器将镰刀菌打孔取出接种于PDA 培养基中，将已接种的培养基放入干燥器中密闭熏蒸处理，3 次重复，并设置空白对照，每24 h 取出用十字交叉法测量菌饼直径并记录。

1.3.3 30%氯化苦乳油对经过pH胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果采用PDA 培养基培养，在PDA 培养基中加入NaOH或HCl，分别调配成pH 5、6、7、8、9的培养基，用直径为1 cm的打孔器将培养好的镰刀菌打孔取出，接种于上述不同pH 的培养基中放置于电热恒温培养箱（温度：28℃）培养120 h，直至对照组(CK)pH 7 的培养基已基本长满。即获得不同pH 下培养的镰刀菌。将在不同pH下培养好的镰刀菌放置于干燥器中，内置有效成分含量为0.21 mg/L 的30%氯化苦乳油进行熏蒸处理，处理时间为72 h。

处理结束后将其取出，接种直径为1 cm的镰刀菌菌饼于培养基中央并放置于恒温培养箱（温度28℃）培养120 h，3次重复，并设置空白对照，每24 h取出用十字交叉法测量菌饼直径并记录，计算其抑制率。

1.3.4 30%氯化苦乳油对经过不同盐浓度胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果采用PDA 培养基培养，在PDA 培养基中加入NaCl，分别配成含盐量为10、100、200、400、800 mmol/L的培养基，用直径为1 cm的打孔器将事先培养的镰刀菌打孔取出，接种于上述不同含盐量的培养基中并放置于电热恒温培养箱（温度28℃）培养120 h，直至对照组含盐量为0 mmol/L的培养基已基本长满。即获得不同含盐量下培养的镰刀菌。将在不同含盐量下培养好的镰刀菌放置于干燥器中，内置有效成分含量为0.21 mg/L 的30%氯化苦乳油进行熏蒸处理，处理时间为72 h。处理结束后将其取出，接种直径为1 cm 的镰刀菌菌饼于培养基中央并放置于恒温培养箱（温度28℃）培养，3 次重复，并设置空白对照，每24 h 取出用十字交叉法测量菌饼直径并记录，直至空白对照菌落长满整个培养皿为止。计算其抑制率。

1.3.5 30%氯化苦乳油对经过极端温度胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果采用PDA 培养基培养，将镰刀菌接种与培养基培养，分别放置于4℃冰箱、40℃恒温培养箱培养5、10、15天。对照组镰刀菌置于28℃恒温培养箱培养120 h，3次重复，待培养结束后，即获得4、40℃温度下培养的镰刀菌。将在不同温度下培养好的镰刀菌放置于干燥器中，内置有效成分含量为0.21 mg/L的30%氯化苦乳油进行熏蒸处理，处理时间为72 h。处理结束后将其取出，接种直径为1 cm的镰刀菌菌饼于培养基中央并放置于恒温培养箱（温度28℃）培养，3次重复，并设置空白对照，每24 h取出用十字交叉法测量菌饼直径并记录，直至空白对照菌落长满整个培养皿为止，计算其抑制率。

1.3.6 统计与分析抑制率的计算见公式(1)。

使用Excel 2010、SPSS 1.9 统计分析试验数据，并用DPS 7.5 Duncan新复极差法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 3种熏蒸剂对镰刀菌的抑制率

通过表1 可以看出，30%氯化苦乳油对镰刀菌的熏蒸效果比较明显，同一个稀释倍数下抑制率显著高于其他2种药剂。30%氯化苦乳油在稀释2000倍时的抑菌率都高于30%1,3-二氯丙烯油悬浮剂和50%氰氨化钙颗粒剂稀释500倍时的抑菌率，30%1,3-二氯丙烯油悬浮剂和50%氰氨化钙颗粒剂稀释倍数很低时，熏蒸效果也不好，同一种药剂对镰刀菌的熏蒸效果随着稀释倍数的增加而降低。

表1 3种熏蒸剂对镰刀菌的抑制率 %

2.2 3种熏蒸剂对镰刀菌的毒力

表2表明，30%氯化苦乳油对镰刀菌的毒力最高，EC50为0.21 mg/L，30%1,3-二氯丙烯油悬浮剂的毒力次之，EC50为1.05 mg/L，50%氰氨化钙颗粒剂对镰刀菌毒力最低，EC50为20.61 mg/L，故本研究后续试验选取30%氯化苦乳油作为试验药剂。

2.3 30%氯化苦乳油对经过pH 胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果

由表3表明，不管培养时间多长，30%氯化苦乳油对经过pH 5、6、8、9 处理的镰刀菌熏蒸效果都比对照pH 7的熏蒸效果差，表现出显著性差异，4个处理在培养48 h时抑菌率差异不显著。培养120 h以后pH 6的处理表现出最小的抑制率，菌丝生长最快。pH 5、9的处理对镰刀菌的抑制率基本相同，都显著小于pH 7的抑制率。随着培养时间的增加，所有处理对镰刀菌的抑菌率基本都呈下降的趋势，在培养120 h以后抑制率达到最小。

表2 3种熏蒸剂对镰刀菌的毒力测定

表3 30%氯化苦乳油对经过pH值胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果

2.4 30%氯化苦乳油对经过不同盐浓度胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果

表4 表明，培养时间在96 h 之前对照组对镰刀菌的抑制率都是最高的，而且显著高于经过不同盐胁迫的各处理。随着盐浓度的增加，抑制率呈下降趋势，盐浓度为800 mmol/L 时菌丝生长最好，抑制率达到最小。培养48 h以后各处理对镰刀菌的抑制率随时间的增加呈下降趋势，在培养120 h时达到最低值。

2.5 30%氯化苦乳油对经过极端温度胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果

表5数据表明，对照组28℃（5天）对镰刀菌的抑制率与极端温度处理组40℃（10 天）、40℃（5 天）、4℃（15天）、4℃（10 天）相比都表现出显著性差异，极端温度4℃（5天）处理组除96 h时，其他时间段对镰刀菌的抑制率也都显著低于对照组。处理组40℃（15 天）菌丝生长最慢、最少，抑菌率达到最大。除了处理组40℃（15天）外，其他处理在培养48 h以后抑菌率都呈下降趋势，在培养120 h时都达到最小抑菌率，极端温度4℃处理随着处理时间的增加，对镰刀菌的抑制率呈下降趋势。

3 结论

3.1 30%氯化苦乳油对经过pH 值胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果

30%氯化苦乳油对镰刀菌有较好的直接熏蒸效果，但经pH（偏酸或偏碱）胁迫处理后的镰刀菌对30%氯化苦乳油表现出不敏感，反而比对照生长更好，熏蒸效果变差。近年来，随着长期连作，大量农药的不合理使用，导致土壤pH值多偏酸性，有些地块土壤pH 5以下，用土壤熏蒸剂对其治理时，镰刀菌对熏蒸剂表现不敏感，从而导致防治效果大大降低，这就给由镰刀菌引起的多种土传病害的治理提出了更大的挑战。

表4 30%氯化苦乳油对经过不同盐浓度胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果

表5 30%氯化苦乳油对经过极端温度胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果

3.2 30%氯化苦乳油对经过不同盐浓度胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果

试验结果表明，经盐胁迫下的镰刀菌对30%氯化苦乳油不敏感，熏蒸再接种后菌丝生长率比对照更好，随着盐浓度的增加抑制率逐渐降低，说明高盐条件下土壤熏蒸剂对镰刀菌的熏蒸效果变差，而随着化肥和农药的大量使用，盐碱地日益增多，使得镰刀菌对熏蒸剂表现越来越不敏感，对田间防治效果产生了巨大的影响。

3.3 30%氯化苦乳油对经过极端温度胁迫处理的镰刀菌的熏蒸效果

病原菌的越冬越夏环节是病原菌完成其生活史的重要步骤，探究镰刀菌在极端温度下对药剂的敏感性至关重要。本试验结果显示，在极端温度下镰刀菌对土壤熏蒸剂的敏感程度并不同，经过高温和低温处理后镰刀菌对外界有更好的抵抗能力。

4 讨论

中国是一个农业大国，农业的安全与发展关乎国家经济的发展与国家安全，改革开放以来由于保护地栽培技术在中国的普及和应用，极大地加快了农业经济的发展，但是随着重茬种植的大面积推广，农药化肥的大量使用，使得土壤中的病原菌、害虫、杂草日益增多，给农业经济的发展造成了巨大影响。土壤熏蒸是目前保护地农业生产中防治土传病害最经济最有效的措施，可有效控制土壤中的连茬病虫害[16]。土壤熏蒸剂能有效防治由腐霉菌镰刀菌丝核菌等引起的沤根烂秧病、猝倒病、立枯病、软腐病、根腐病、枯萎病、黄萎病等土传病害及预防根结线虫，清洁土壤，为植株创造良好的生长环境[17-18]。从十字花科蔬菜中提取的辣根素对多种土传病害和部分气传病害有防控作用[19]，威百亩进行土壤消毒后施用生物菌肥能明显提高番茄产量[20]，使用棉隆对草莓地消毒以后能使草莓增产20%以上[21]，威百亩处理土壤能有效防治由尖孢镰刀菌引起的黄瓜枯萎病和瓜果腐霉引起的黄瓜猝倒病，有效提高黄瓜品质与产量[22]，二甲基二硫熏蒸土壤后，能有效防治线虫、土传真菌、杂草等[23]。

土壤熏蒸剂在土壤中的分解强度取决于土壤的理化性质和熏蒸剂的类型。理想的熏蒸剂需要靶标有害生物尽可能长时间地暴露于药剂中，而且病原菌要对熏蒸剂敏感，才能取得较好的防效[15]。土壤质地不同，栽培管理模式不同，相应的理化指标如土壤的pH、有机质含量、盐含量等也会有很大差异，这些都会对土壤熏蒸剂的熏蒸效果产生重要的影响。本研究结果表明，在相应的土壤理化性质改变后（土壤pH偏酸偏碱，土壤盐含量增加），能够使得土壤病原菌（镰刀菌）对土壤熏蒸剂（30%氯化苦乳油）表现出不敏感，降低了防治效果，增加了防治难度。假设通过某种物理或者化学的方法让镰刀菌重新对熏蒸剂敏感，这样就能在很小的用药量下取得很好的防治效果，这也是笔者下一步将会开展的研究工作。