拟南芥晚花突变体fve—1和fca—1营养生长时相转变

刘新庆 郭蕊 范晓宁 王雪 龙鸿

摘 要 拟南芥胚后发育经历了营养生长和生殖生长两个主要阶段，在营养生长的过程中，由幼龄期向成熟期的转变称为营养生长时相转变。有关这个转变的基因调控网络仍不清楚。本文对拟南芥晚花突变体fca-1、fve-1的营养生长时相转变过程进行了形态学观察和基因表达分析。结果表明：与野生型相比，fve-1、fca-1植株幼龄期延长，导致营养生长时相转变延迟。自主开花基因FVE、FCA参与了植物营养生长时相转变的调控。

关键词 营养生长时相转变 ；miR156 ；fve-1 ；fca-1 ；拟南芥

中图分类号 Q754 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.06.010

Vegetative Phase Change in Late-flowering Mutants fve-1 and fca-1

in Arabidopsis thaliana

LIU Xinqing1） GUO Rui1） FAN Xiaoning2） WANGXue1） LONG Hong1）

（1 College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384

2 College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University，

Wuhan， Hubei 430070）

Abstract Post-embryo development of Arabidopsis thaliana undergoes two main stages， namely， vegetative and reproductive growth phase. The change in vegetative growth from juvenile to adult refers to vegetative phase change. The gene network of regulating vegetative phase change remains unclear. In this paper， morphological observation and gene expression are performed to analyze the vegetative phase change in two late-flowering mutants， namely， fca-1 and fve-1. The results showed that compared with the wild type Ler， both vegetative phase change and blossoming in fca-1 and fve-1 mutants are delayed. And this cause the vegetative phase change delay. Autonomous pathway related gene FVE and FCA of flowering time of Arabidopsis thaliana can regulate the vegetative phase change.

Keywords vegetative phase change ； miR156 ； mutant ； fca-1 ； fve-1 ； Arabidopsis thaliana

高等植物的生命周期主要分为两个阶段，以根茎叶生长发育为标志的营养生长阶段和以开花为标志的生殖生长阶段[1]。营养生长时期又可分为幼龄期（Juvenile phase）和成熟期（Adult stage），幼龄期不能诱导开花，只有进入成熟期后植物才能经诱导开花[2]，植物由幼龄期向成熟期的转变称为营养生长时相转变（Vegetative phase change， VPC）[3]。植物营养生长时相转变伴随的表型变异大多是渐变的。模式植物拟南芥中，幼龄期叶片近圆形，叶缘全缘，叶柄较长；成熟期叶片呈卵圆形，叶缘有锯齿，叶柄较短。然而，成熟期叶片出现幼龄期所没有的远轴面表皮毛，这一表型可以作为判定VPC的形态标志[4-5]。

植物时相转变是受特定基因调控的。研究表明，一种小分子RNA（miRNA）， miR156及其靶基因SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE（SPL）基因家族参与了植物营养生长时相转变和开花。miR156促进幼龄期生长而抑制成熟期生长，即抑制VPC发生，其表达水平在幼龄期较高而在成熟期降低，开花后进一步降低；SPL3基因则促进了营养生长时相转变，并受到miR156的强烈抑制[6]。

开花是植物对环境因素和内源因子的响应结果[7-9]。拟南芥中控制开花的途径包括：光周期途径、自主开花途径、春化途径和赤霉素途径[7，10]。自主开花途径是指植物对外界环境都不敏感，依靠体内各相关基因之间的相互协同和拮抗作用而使植物达到一定生长时期后开花。自主开花途径的基因如FLOWERING LOCUS VE（FVE）、FLOWERING LOCUS CA（FCA）、LUMINIDE ENDENS（LD）等是通过抑制春化途径关键基因FLOWERING LOCUS C（FLC）的表达来促进开花的[11]。fca-1、fve-1、fpa-1等晚花突变体开花晚于相应野生型[12]，然而这些基因对营养生长时相转变的影响，尤其是miR156的作用仍不清楚。本研究以拟南芥晚花突变体fca-1、fve-1为材料，通过形态学观察和基因表达分析，探讨拟南芥营养生长时相转变过程中开花基因FCA、FVE的作用，为研究开花基因与营养生长时相转变之间的内在机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型拟南芥为Landsberg erecta（Ler）生态型，突变体为Ler背景下的fve-1、fca-1。Ler种子由作物遗传改良国家重点实验室须健教授课题组惠赠，fve-1、fca-1购自Arabidopsis Biological Resource Center（ABRC）。

1.2 方法

1.2.1 材料培养

将拟南芥种子置于含湿滤纸的培养皿中，4℃冰箱中春化2～3 d。蛭石与营养土按体积比1∶1混合成培养土，121℃高温高压湿热灭菌后浸湿用于播种。播种后用保鲜膜覆盖约一周以保湿。培养箱采用人工光照，光强为90 μE/cm2·s，光照时间∶暗培养时间=16 h∶8 h。光照温度22℃，黑暗温度20℃，空气相对湿度约60%。

1.2.2 形态学鉴定

观察拟南芥野生型Ler，突变体fve-1、fca-1植株，记录开花时间、莲座叶数目、产生远轴面表皮毛的叶片数，莲座叶叶片的长和宽，计算长宽比值并制作柱状图。在体视显微镜下，观察远轴面表皮毛的产生时间，并进行统计学分析，各个材料样本数均为20株，重复3次。

1.2.3 RT-PCR

采用Trizol法提取不同天数（每5 d取1次）Ler、fca-1、fve-1植株的总RNA（单个样本均为多株提取）。采用DNase I消化总RNA中的DNA。利用反转录试剂盒（TaKaRa）进行cDNA的合成。引物名称与序列如下：

ActinF，5′-GCAGACCGTATGAGCAAAGA-3′；

ActinR，5′-AGCAAGGATAGAACCACCAA-3′；

miR156a-F，5′-CTCTCCCTCCCTCTCTTTGATTC-3′；

miR156a-R，5′-AGGCCAAAGAGATCAGCACCGG-3′。

以cDNA为模板进行RT-PCR扩增，以Actin为对照，RT-PCR扩增程序如下：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，58 ℃复性30 s，72℃延伸20 s，共38个循环；72℃延伸10 min，-20℃保存。每个样品重复3次。

使用0.5×TBE溶液配制1%琼脂糖凝胶，取10 μL PCR产物点样，电泳检测目的条带，观测反转录效果并观察基因表达的趋势。

2 结果与分析

2.1 突变体fve-1、fca-1的总莲座叶数比野生型明显增多

fve-1、fca-1突变体和野生型的发育形态观察结果显示，fve-1、fca-1突变体植株的总莲座叶数及叶片特征等方面出现与野生型明显不同的异常表型。生长35 d时Ler植株已开花结果，而fve-1、fca-1植株尚未出现花序（图1A），说明fve-1、fca-1突变体比野生型发育迟滞，开花晚。fve-1、fca-1植株的叶片比野生型增大（图1A），Ler、fve-1、fca-1总莲座叶数分别为7、21、17，突变体比野生型明显增多，其中fve-1的总莲座叶数最多（图1B）。叶片增大、增多的结果表明，fve-1、fca-1突变体植株发育迟滞。

2.2 fve-1、fca-1突变体植株叶片特征显示其营养生长时相转变延迟

在拟南芥营养生长时相转变中，叶形是渐变的特征，幼龄期近圆形，成熟期呈卵圆形；而成熟期叶片会出现幼龄期所没有的远轴面表皮毛。形态观察显示，Ler植株的远轴面表皮毛在14 d出现，而fve-1、fca-1则分别在19、18 d出现（图2）。两个突变体植株叶片远轴面表皮毛的出现较Ler晚，说明fve-1、fca-1植株幼龄期延长，营养生长时相转变延迟。Ler植株生长约20 d出现可见花芽，而fve-1在40 d时才出现花序，fca-1约在38 d出现花序（图2）。

叶形观察表明，野生型Ler的子叶和第1、2片莲座叶近圆形，叶片长宽比约为1，后期的叶片稍呈卵圆形，开始生长远轴面表皮毛的第4片叶与之前的莲座叶相比变化明显，叶片长宽比大于1.5；fve-1、fca-1突变体第一对真叶长宽比均约为1，叶片近似为圆形。随后叶形由圆形逐渐变成椭圆形，长宽比逐渐增大。fve-1和fca-1植株叶片长宽比分别在开始生长远轴面表皮毛的第6和第7片叶时达到1.5（图3）。这些结果说明，fve-1、fca-1植株营养生长时相转变延迟。

2.3 fve-1、fca-1营养生长时期miR156表达量变化

鉴于miR156参与了拟南芥营养生长时相转变，本研究检测了fve-1、fca-1突变体各发育时期其表达量的变化。RT-PCR结果表明，Ler野生型在生长10 d时，miR156a的表达量为最高，在15 d时开始降低，20 d时明显降低，25 d时RT-PCR条带基本看不到；fca-1和fve-1突变体生长10 d时，miR156a的表达量为最高，fca-1在15 d时也开始降低，在20～25 d时明显降低，30 d时RT-PCR条带基本消失，而fve-1中miR156的表达量下降更缓慢，在20 d时开始降低，25 d时明显降低，35 d时条带基本消失。野生型和突变体在发育早期中miR156a的表达量均很高，野生型在15 d时miR156a的表达量有所下降，在15～20 d时下降明显，说明发生营养生长时相转变；此时，fve-1突变体中miR156a的表达量仍较高，fve-1和fca-1的miR156a表达量均在20～25 d时下降较明显，说明晚于野生型发生营养生长时相转变（图4）。

3 讨论

拟南芥器官形态的变化贯穿于全部植物发育的过程中，这种变化与植物顶端分生组织的发生和分化相关，并受特定基因的表达调控[13-14]。营养生长阶段时相转变是与生殖能力相关的[15]，然而控制开花的基因是否参与营养生长时相转变仍不清楚。本研究结果表明，拟南芥的自主开花基因FVE、FCA参与了营养生长时相转变的调控。突变体fve-1、fca-1的总莲座叶数比野生型明显增多，发育进程延迟。这与我们前期利用多叶突变体amp1-1为材料的遗传分析结论相似，多叶突变体amp1-1发育进程延迟[16]。在长日照条件下，突变体fve-1、fca-1叶片远轴面表皮毛出现的时间（分别为19和18 d）比野生型Ler（14 d）晚，说明Ler从14 d进入营养生长的成熟期，而fve-1、fca-1则分别是在19、18 d，fve-1、fca-1植株幼龄期明显增长，从而导致成熟期也相应的推迟。叶形和叶片长宽比的实验结果也支持以上结论。Ler、fve-1、fca-1分别在20、40、38 d产生花序，进入生殖生长阶段，突变体fve-1、fca-1进入生殖生长时期也明显晚于野生型。

植物生长发育时相转变的基因调控网络尚不清楚。研究表明，小RNA及其靶基因参与了调控植物营养生长时相转变的过程[11]。microRNA（miRNA）为内源性的非编码小RNA，它们可与靶mRNA的3'非编码区结合，从而降解靶基因的mRNA或抑制转录物的蛋白翻译，进而调控有机体生长、分化、发育[17]。近年来，已经越来越清楚的是，幼龄期到成熟期时相转变及生殖生长时相转变共享一些主要的调控因子，特别是，两个进化上高度保守的小RNA，miR156和miR172，以及它们的靶标，是植物生长时相转变遗传调控机制的关键组分[6，16，18]。miR156靶定SPL转录因子家族，调控幼龄期到成熟期及开花的转变。相反，miR172靶定2个APETALA2（AP2）的DNA结合结构域编码蛋白的mRNA，与miR156相互拮抗调控幼龄期到成熟期及开花的转变[15，19-20]。miR156在幼龄期高表达，而在成熟期则下降；组成型超表达miR156延长了幼龄期的性状，而miR156活性丧失则这些性状消除，说明miR156是幼龄期发育的充分必要条件[15]。本研究表明，无论是野生型还是突变体，当拟南芥处于幼龄期时，miR156表达量均很高，伴随着植物发育的进程，miR156表达量逐渐下降，从miR156下调表达量分析，fve-1和fca-1突变体比Ler野生型进入成熟期延迟，这个结果与形态学观察的结果相一致。进入生殖生长时期，miR156表达量进一步降低，fve-1和fca-1中miR156表达量比野生型的下降缓慢。这样，fve-1和fca-1晚花突变体在延迟开花的同时，它们的营养生长阶段也被延长。自主开花基因FVE、FCA对幼龄期和成熟期的植株有促进其生长发育的作用，可以缩短这两个时期生长发育的时间，从而对植物的生长发育过程进行调节，这些基因突变后营养生长时相转变延迟，植株晚花。

参考文献

[1] Xu Z H， Chong K. Plant development biology in china：past， present and future[J]. Acta Botanica Sinica， 2002， 44（9）： 1 085-1 095.

[2] Willmann M R， Poethig R S. The effect of the floral repressor FLC on the timing and progression of vegetative phase change in Arabidopsis[J]. Development， 2011， 138（4）： 677-685.

[3] Poethig R S. The past， present， and future of vegetative phase change[J]. Plant Physiol， 2010， 154： 541-544.

[4] Chien J C， Sussex L M. Differential regulation of trichome formation on the adaxial and abaxial leaf surfaces by gibberellins and photoperiod in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Physiol， 1996， 111： 1 321-1 328.

[5] Telfer A， Bollman K M， Poethig R S. Phase change and the regulation of trichome distribution in Arabidopsis thaliana[J]. Development， 1997， 124： 645-654.

[6] Wu G， Poethig R S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3[J]. Development， 2006， 133： 3 539-3 547.

[7] Amasino R M， Michaels S D. The Timing of flowering[J]. Plant Physiol， 2010， 154（2）： 516-520.

[8] Gordon G， Simpson， Dean C. Arabidopsis， the Rosetta Stone of Flowering Time[J]. Science， 2002， 296： 285-289.

[9] Richard Amasino. Seasonal and developmental timing of flowering[J]. The Plant Journal， 2010， 61： 1 001–1 013.

[10] Mouradov A， Cremer F， Coupland G. Control of flowering time interacting pathways as a basis for diversity[J]. Plant Cell， 2002， 14： 111-130.

[11] Liu F Q， Quesada V， Creville P， et al. The arabidopsis RNA-Binding protein FCA requires a lysine-specific demethylase 1 homolog to downregulate FLC[J]. Molecular Cell， 2007， 28： 398-407.

[12] Pineiro M， Coupland G. The control of flowering time and floral identity in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 1998， 117（1）： 1-8.

[13] McDaniel C N， Singer S R， Smith S M E. Developmental states associated with the floral transition[J]. Developmental biology， 1992， 153（1）： 59-69.

[14] Poethig R S. Phase change and the regulation of shoot morphogenesis in plants[J]. Science， 1990， 250（4 983）： 923-930.

[15] Zimmerman R H， Hackett W P， Pharis R P. Hormonal aspects of phase change and precocious flowering[J]. Encycl Plant Physiol， 1985， 11： 79-115.

[16] 卢 阳，龙 鸿. 拟南芥叶片数目变化突变体对营养生长时相转变的影响[J]. 植物学报，2015，50（3）：331-337.

[17] Carrington J C， Ambros V. Role of microRNAs in plant and animal development[J]. Science， 2003， 301（5 631）： 336-338.

[18] Huijser P， Schmid M. The control of developmental phase transitions in plants[J]. Development， 2011， 138： 4 117-4 129.