牛角瓜花粉萌发及花粉管生长研究

宾珍兰 汤丹峰 周瑞阳

摘 要 运用方差分析、多重比较、正交实验和极差分析方法，对牛角瓜花粉的萌发和花粉管生长进行研究，结果表明，培养基内硼酸、硝酸钙、蔗糖、硫酸镁在一定浓度范围内，对花粉萌发及花粉管生长起促进作用，但浓度过高或过低时，则有抑制作用；钾对花粉萌发及花粉管生长影响不显著；蔗糖和硝酸钙对牛角瓜花粉萌发有显著影响，蔗糖和硫酸镁对牛角瓜花粉管生长有显著影响；牛角瓜最适花粉液体培养基为：15% 蔗糖+350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+60 mg/L H3BO3+150 mg/L MgSO4·7H2O；在30～35℃温度条件下，牛角瓜花粉块萌发和花粉管生长最好。

关键词 牛角瓜 ；花粉 ；花粉管生长 ；离体萌发 ；生长条件

中图分类号 S567.19 文献标志码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.014

Abstract Pollen germination and pollen tube growth of Calotropis gigantea was tested by using One-Way ANOVA， multiple comparison， an orthogonal experiment and range analysis The results indicated that the pollen germination and pollen tube growth would be enhanced when the concentration of borate， calcium nitrate， magnesium sulphate and sucrose of the culture medium were within a certain range. When the concentration is too high or low， the pollen germination and pollen tube growth would be inhibited. Potassium has little impact on pollen tube growth and pollen germination. Sucrose and calcium nitrate have significant effect on pollen germination， sucrose and magnesium sulphate have significant effect on pollen tube growth. The optimum culture medium and environment conditions which support the germination and growth are 15% sucrose+350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+60 mg/L H3BO3+150 mg/L MgSO4·7H2O. The pollen germination and the growth of pollen tube will be better under 30～35℃.

Keywords Calotropis gigantea. ； pollen ； pollen tube ； germination in vitro ； growth conditions

牛角瓜（Calotropis gigantea）属萝藦科牛角瓜属植物，又名断肠草、五狗卧花。牛角瓜属植物有6种，广泛分布于亚洲和非洲的热带、亚热带地区[1]。中国有1种，生于低海拔向阳坡及空旷地，主要分布于四川、广西、广东、海南及云南等地[2]。牛角瓜作为一种传统的药用植物，其根、茎、叶和果等均可药用，具有消炎、抗菌、化痰和解毒抗癌等作用[3-4]。同时其乳汁具有强心保肝[5-6]、镇痛消炎[7-8]等疗效，树皮可治癫癣。牛角瓜纤维是种子附属物，近年来有研究发现，由于其具有纤维细长、中空度大、能抑菌、纤维表面有光泽等显著特点，可作为一种新型的植物纤维开发利用[9-10]。目前，对牛角瓜纤维的研究主要集中在栽培种植管理上[11-12]，而对牛角瓜育种及花粉块萌发的相关研究未见报道。本试验以牛角瓜为研究材料，探究其花粉块的离体萌发及花粉管生长条件，为牛角瓜花粉保存和优良品种选育提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

牛角瓜花采集于广西大学农学院试验地，取盛开的牛角瓜花药中成熟的花粉块供实验用。

1.2 方法

采用液体培养法，参照B-K[13]试液[10%蔗糖，100 mg/L H3BO3，300 mg/L Ca（NO3）2·4H2O，200 mg/L MgSO4·7H2O，100 mg/L KNO3]，将试验培养液倒入培养皿中，花粉块从花药中取出置于培养基上，放入33℃人工气候箱中培养，观察并记录结果。

1.2.1 培养条件

用B-K试液进行培养时间、温度梯度对牛角瓜花粉块离体培养条件影响的试验。培养时间设为2、4、6、8 h；温度设为5、10、15、20、25、30、35、40℃。

1.2.2 培养基单组分筛选

试验参照B-K试液中的5个组分，单一组分浓度改变，其余4组分参照B-K试液浓度。分别设置以下处理：蔗糖浓度梯度分别为 0、5%、10%、15%、20%、30%；H3BO3浓度梯度分别为0、20、40、60、80、100、120、150 mg/L；Ca（NO3）2·4H2O浓度梯度分别为0、100、200、300、400 mg/L；MgSO4·7H2O浓度梯度分别为0、50、100、150、200、250、300 mg/L；KNO3浓度梯度分别为0、40、80、120、150 mg/L。

1.2.3 最佳培养基的选择

根据单组分筛选结果，选择对牛角瓜花粉块离体培养影响显著的因子，并根据所选因子的最佳浓度水平的前后2个浓度（单因素试验中的浓度）来确定该影响因子的浓度，设计正交实验，统计各个正交实验的花粉块萌发率和花粉管长度，并对实验结果进行统计分析，选择最佳牛角瓜花粉块离体培养基。

2 结果与分析

2.1 培养条件对花粉离体培养的影响

2.1.1 培养时间

牛角瓜花粉粒聚集形成花粉块，人为破损单散出来的花粉粒不萌发，自然条件下以花粉块为单位萌发。培养时间不同，花粉萌发率和花粉管长度有差异，随着培养时间延长，花粉块萌发率增大，花粉管长度增加（图1-A，1-B）。培养6 h后，花粉块萌发率可达84.43%，方差分析结果显示，培养6与8 h萌发率无显著差异（p>0.05）；花粉管依然在生长，且花粉管会出现胼胝质塞。

2.1.2 温度

温度影响花粉块萌发率及花粉管生长，如（图2-A、2-B）。温度在10℃以下，花粉不萌发。到达35℃时，花粉块萌发率达到最大值97.78%，此时花粉管长度也达到最大值1.06 cm。40℃后，萌发率降到24.4%，花粉管长度仅0.08 cm。方差分析结果表明：萌发率和花粉管长度在30和35℃时无显著差异（p>0.05），因此，最适培养温度在30～35℃。

2.2 不同培养基组分对花粉块离体培养的影响

2.2.1 蔗糖

从（图3-A、3-B）可知，随着培养基内蔗糖浓度增加，花粉块萌发率逐渐增大。当浓度达到15%时，花粉块萌发率达到最大值93.33%；但浓度超过30%时，对花粉块的萌发有抑制作用。蔗糖能促进花粉管生长，蔗糖浓度达到5%时，花粉管长度达到0.96 cm，是对照（培养基内不加蔗糖）的19.2倍，方差分析结果表明：萌发率在15%浓度下与对照、5%、10%、30%的浓度存在显著差异（p<0.05），花粉管在15%蔗糖浓度下，除与对照有显著差异外，与其他浓度均无显著差异（p<0.05）。综合分析蔗糖的最适浓度为15%。

2.2.2 硼酸

在一定浓度范围内，花粉块萌发率随培养基内H3BO3浓度的增加而增加，但超过一定浓度时，H3BO3对牛角瓜花粉块萌发率和花粉管生长有抑制作用。花粉块萌发率最高的H3BO3浓度为80 mg/L，萌发率达到93.33%（图4-A）。低浓度H3BO3对牛角瓜花粉管长度影响不大，但浓度超过150 mg/L时会抑制花粉管生长（图4-B）。方差分析结果表明，H3BO3浓度在80和100 mg/L时，萌发率无显著差异（p>0.05），而花粉管长度在80和100 mg/L浓度时长势较好。因此，H3BO3的最佳浓度为80～100 mg/L。

2.2.3 钙

在一定浓度范围内，随钙浓度的增加，花粉萌发率增大，超过一定浓度后，萌发率下降（图5-A）。钙离子浓度为300 mg/L，花粉块萌发率最大为95.57%；钙离子浓度达到一定值时能促进花粉管的生长（图5-B）。方差分析结果表明：在钙离子浓度为300 mg/L时，花粉萌发率与其他浓度的有显著差异（p<0.05）；钙离子浓度在300 mg/L时，与对照和钙离子浓度为100 mg/L有显著差异，而与200、400 mg/L无显著差异。因此，选择最佳钙离子浓度为300 mg/L。

2.2.4 镁

镁对花粉块萌发的影响与硼酸具有相同的趋势。在一定浓度范围内，随着镁浓度的增加，花粉块萌发率增大，超过一定浓度后，萌发率下降（图6-A）；镁离子浓度为200 mg/L，花粉块萌发率最大，为91.10%。镁离子浓度达到250 mg/L后会抑制花粉管伸长（图6-B）。方差分析结果表明：在镁离子浓度为200 mg/L时，花粉块萌发率和花粉管长度与其他浓度有显著差异（p<0.05）。因此，镁的最佳浓度为200 mg/L。

2.2.5 钾

钾在浓度梯度实验中并未表现出促进和抑制花粉块萌发率的状况（图7-A、7-B），因此，钾对牛角瓜花粉块萌发影响不显著。

2.3 牛角瓜花粉块正交试验结果分析

根据单因素试验结果分析可知，最佳蔗糖浓度为15%，钙离子的最适浓度为300 mg/L，镁离子的最适浓度为200 mg/L，硼的最适浓度是80 mg/L，钾离子对花粉萌发无显著影响，因此选定前4个作为影响因子，并根据各因子的最佳浓度左右的2个浓度（单因素试验中设定的浓度），各个因素设定3个浓度水平，即蔗糖浓度选择了10%、15%、20%；Ca（NO3）2·4H2O浓度250、300、350 mg/L；MgSO4·7H20浓度150、200、250 mg/L；H3BO3浓度60、80、100 mg/ L；用SPSS18设计L9（34）的正交试验（表1）。

根据影响花粉萌发率的正交试验极差分析与方差分析，结果显示（表2）：蔗糖浓度的第一个水平浓度K1 的萌发率98.67%大于第二个水平浓度K2的萌发率93.47%大于第三个水平浓度K3萌发率 89.98%，同样，钙离子3个浓度水平对萌发率影响结果顺序为K3（97.75%）>K1（93.52%）>K2（90.89%）；3个浓度水平的镁离子对萌发率影响结果为K1（96.67%）>K2（94.29%）>K3（91.16%）；硼酸对萌发率影响结果为K3（94.58%）>K2（94.27%）>K1（93.26%）。在K1～K3浓度区间内，蔗糖和钙离子较镁与硼酸影响差异显著，4个因素对萌发率的影响，极差分析与方差分析结果相同，即钙离子>蔗糖>镁离子>硼酸，此时，培养基的最优组合为钙离子K3+蔗糖K1+镁离子K1+硼酸K3，即350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+10%蔗糖+150 mg/L MgSO4·7H20+100 mg/L H3BO3。

同理，影响花粉管生长的正交试验极差分析与方差分析结果（表3）显示：蔗糖3个浓度水平对花粉管生长影响顺序为K3（0.93 cm）>K2（0.90 cm）>K1（0.69 cm）；钙离子为K3（0.88 cm）>K1（0.85 cm）>K2（0.79 cm）；镁离子为K1（0.96 cm）>K2（0.80 cm）>K3（0.76 cm）；硼酸为K1（0.85 cm）=K2（0.85 cm）>K3（0.82 cm）。且在K1～K3浓度区间内，蔗糖和镁较钙离子与硼酸影响差异显著，4个因素对花粉管生长影响顺序为蔗糖>镁>钙>硼酸；各因素的最佳组合为钙K3+蔗糖K3+镁K1+硼酸K1，即350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+20%蔗糖+150 mg/L MgSO4·7H20+60 mg/L H3BO3。

综合4个因素的正交试验对花粉萌发与花粉管的生长，钙离子选择浓度水平K3；镁离子浓度水平选定为K1；硼酸浓度在K1～K3对花粉萌发率影响不显著。因此，选择的浓度水平为K1；蔗糖浓度对花粉萌发率与花粉管生长的影响综合分析，选定浓度为K2。因此，培养基的最优组合为：15%蔗糖+350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+150 mg/L MgSO4·7H20+60 mg/L H3BO3。

3 讨论

3.1 培养条件对花粉萌发的影响

培养基条件对花粉萌发和花粉管生长有显著的影响。温度过低或过高时也对花粉萌发和花粉管生长起抑制作用，甚至不萌发。牛角瓜花粉离体培养的最适温度在30℃～35℃。牛角瓜花期全年，但盛果期为7～8月。由此可以推测，温度是影响其结实率的重要因素之一。

牛角瓜花粉块在离体培养条件下，培养6 h后，花粉管末端膨大，开始出现胼胝质塞，这可能与离体培养无法完成授精而停止生长，以减少物质能量的耗损有关[14]。

3.2 培养基成分对花粉萌发的影响

蔗糖作为碳源，能为花粉萌发和花粉管的生长提供营养，并能维持外界环境的渗透压，是许多植物花粉离体培养所必需的重要成分[15]。不同植物花粉离体培养基所需的蔗糖浓度不同，如桃[16]、高丛越橘[17]花粉离体培养基蔗糖的最适浓度为10%，黄连木[18]花粉离体培养基蔗糖的最适浓度为15%，薄壳山[19]核桃花粉离体培养基蔗糖的最适浓度为20%。本研究牛角瓜花粉离体培养基蔗糖最适浓度为15%。

一般情况下，花粉自身所含的硼和钙是不足的，自然条件下由柱头和花柱内的硼和钙来补偿[20]。硼酸是通过与花粉管膜中果胶物质作用改变细胞壁的结构和性质来调节花粉管的生长[20-22]。百合[23]花粉离体培养中，硼酸的最适浓度为1 mmol/L，腊梅[24]花粉萌发的最适硼酸浓度是50 mg/L。本研究中，牛角瓜花粉萌发硼酸最适浓度为80 mg/L；硼酸对牛角瓜花粉萌发率有促进作用，但对花粉管生长影响不显著，这个结论与杜纪红[16]等对桃花花粉萌发研究结果一致。

钙是花粉萌发与花粉管生长最重要的信号，一般认为，胞外钙离子通过质膜钙通道进入花粉内起作用，影响花粉萌发与花粉管生长[26]。梨花[25]花粉离体培养的最适钙质量浓度为15% CaCl2，核桃[27]花粉萌发的最适钙离子浓度为40 mg/L CaCl2，本研究牛角瓜花粉萌发的最适钙浓度为350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O。

本研究钾对牛角瓜花粉萌发没有显著影响，此结论与吴开志[27]等研究钾对核桃花粉萌发影响以及权秋梅等对淫羊藿[28]花粉萌发的结论一致。

在花粉离体培养中，培养基不同组分对花粉萌发与花粉生长的影响是不同的，硼酸淫羊藿[28]对花粉萌发有显著影响，钙则在蔗糖与硼酸主导下起辅助作用，镁对其花粉萌发无影响。本试验培养组分中蔗糖和钙对牛角瓜花粉萌发和花粉管的生长有显著影响，硼与镁在蔗糖和钙的主导作用下起辅助作用。牛角瓜花粉离体培养的最佳液体培养基为：15%蔗糖+350 mg/L Ca（NO3）2·4H2O+80 mg/L H3BO3+150 mg/L MgSO4·7H20。

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