海南黄芩挥发油成分分析及生物活性研究

陈欣 陈光英 陈文豪 韩长日 宋小平 吴燕

摘 要 采用水蒸气蒸馏法提取海南黄芩挥发油，用GC-MS对其化学成分进行分离鉴定；采用微量稀释法对挥发油进行抗菌活性测试和MTT比色法进行抗肿瘤活性测试。结果从海南黄芩挥发油中分离得到71个峰，鉴定了其中的54个成分，占挥发油总量的90.42%，其主要成分为：10S，11S-雪松醛-3（12），4-二烯（15.3%）、石竹烯（7.92%）、邻苯二甲酸单乙基己基酯（6.99%）和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（6.54%）。药理活性研究表明，海南黄芩挥发油对白色葡萄球菌等7种菌株未显示抑制活性，而对宫颈癌（Hela）细胞和肺腺癌（A549）细胞具有较好的抑制活性，其IC50值分别为36.56和29.21 μg/mL。海南黄芩挥发油具有丰富的化学成分，药理活性表明，海南黄芩具有较好的抗肿瘤活性。

关键词 海南黄芩 ；挥发油 ；化学成分 ；抗肿瘤活性

中图分类号 TS201.2 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.019

Abstract The essential oil is extracted by steam distillation and the chemical composition of oil is separated and identified by GC-MS. The antibacterial and antitumor activities of volatile oils are tested by microdilution methods and the MTT assay， respectively. 71 chromatographic peaks are detected and 54 compounds are identified， which accounted for 90.42% of the total essential oil. The main components were 10S， 11S-himachala-3（12），4-diene （15.3%）， caryophyllene （7.92%）， monoethyl hexylphthalate （6.99%） and 2-methoxy-4-vinylpheno （6.54%）. The analysis of pharmacological activity shows that the essential oil has no inhibitory activity agaist Staphylococcus albus， but has inhibitory activity agaist Hela and A549. The IC50 values were 36.56 and 29.01 μg/mL， respectively. The Hainan Scutellaria's volatile oil have abundant types of chemical constituents， its antitumor activity is strong.

Keywords Scutellaria hainanensis ； essential oil ； chemical constituent ； anti-tumor activity

唇形科黄芩属（Scutellaria）植物广泛分布于温带和热带山脉地区，遍及欧洲、北美和东亚，约有360多个物种。在我国明确记载的有102种，50个变种，多为药用。2010年版《中国药典》中收录了2种：黄芩（S. baicalensis）和半枝莲（S. barbata D）[1]。现代研究表明，黄芩属植物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗惊厥、抗菌、抗病毒和保肝等作用。其中，黄酮和萜类化合物是黄芩属植物的特征成分，黄酮如黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素具有抗肿瘤、抗HIV、抗菌、抗炎和抗惊厥活性；而萜类化合物Jodrellin A、Jodrellin B、scutalbin A和scutecyprol B表现出很好的抗拒食活性[2]。海南黄芩为唇形科黄芩属植物，为多年生草本，长于石山上，是海南特有物种[3]。目前尚未见关于海南黄芩化学成分与药理活性的文献报道。本文采用水蒸气蒸馏的方法提取海南黄芩的挥发油，并且采用GC-MS联用技术对其挥发油进行成分分析，同时采用纸片琼脂扩散法和MTT比色法分别研究其抗菌和抗肿瘤活性。本研究对海南黄芩挥发油的化学成分及其抗菌抗肿瘤活性进行了研究，以期为海南黄芩的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

海南黄芩（Scutellaria hainanensis），2014年9月采自海南省昌江黎族自治县，经中国医学科学院药用植物研究所海南分所李蓉涛研究员鉴定，标本存放于海南师范大学热带药用植物化学教育部重点实验室。

供试菌种及肿瘤细胞：白色葡萄球菌（Staphylococcus）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、四联球菌（Pediococcus） 和藤黄八叠球菌（Micrococcus luteus）均购于中国科学院微生物研究所；宫颈癌（Hela）、肺腺癌（A549）为中科院上海生物所提供。

1.1.2 仪器与试剂

5975B/6890N 型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）、Elx800型酶标仪（美国宝特公司）、智能恒温恒湿箱（宁波海曙赛福实验仪器厂）、高压灭菌锅（日本森展企业有限公司）、ELx808吸收光酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）、超净工作台（苏州净化设备厂）、可调式移液器（BRAND公司）、96孔细胞培养板（Pore公司）、电子天平（Sartious公司）、二甲基亚砜（DMSO）（天津市化学试剂二厂）、RPMI 1640培养液（Gibco公司）、胰酶（Gibco公司）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma公司）、胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司）。实验所用试剂均为市售分析纯，水为蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 实验条件

GC-MS分析色谱条件：石英毛细管柱HP-FFAP（250 m×30 m×0.25 m），初始温度50℃，保持1 min，以2℃/min速率升温到70℃保持2 min，以5℃/min升温速率到280℃保持至完成分析，载气为He（99.99%），柱流量1.0 mL/min，进样口温度250℃，分流比50∶1。质谱条件：电离方式为EI电子源，电子能量为70 eV，离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，溶剂延迟为2.5 min，全扫描（Scan）采集模式，质量范围m/z 38～698，扫描间隔0.50 s，EM电压1 400 V。

1.2.2 挥发油的提取

海南黄芩挥发油的提取：将半干燥的海南黄芩总重量230 g，剪碎，分2次用水蒸气蒸馏法[5]提取挥发油，再用无水乙醚萃取3次，萃取液加无水硫酸钠干燥，30℃水浴蒸馏回收乙醚，最后得到具有芳香性气味，淡黄色油状液体，重量为1.296 g，得油率为0.56%。

1.2.3 体外抗菌实验

采用微量稀释法，对以下7种致病菌菌株进行抗菌测试：藤黄八叠球菌（Micrococcus luteus）ATCC 11001，大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 27154，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）ATCC 8799，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ACCC 11077，四联球菌（Micrococcus tetragenus）ATCC 13623和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ACCC 11060。将一定量的海南黄芩挥发油溶于1 mL的DMSO中，得到储备溶液。菌种在37℃条件下，接种于营养肉汤中震荡过夜，使用时稀释至106 cfu/mL。营养肉汤培养基作空白对照，DMSO用作阴性对照，环丙沙星作阳性对照。

1.2.4 体外抗肿瘤实验

挥发油抗肿瘤活性测试：用含10%胎牛血清的培养液（DMEM）配成单个细胞悬液，以每孔5 000个细胞接种到96孔板，每孔体积100 μL，贴壁细胞提前12 h接种培养。加入待测样品溶液（固定浓度40 μg/mL初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50%附近的化合物设5个浓度进入梯度复筛）100 μL，每孔终体积100 μL，每种处理均设3个复孔。37℃培养48 h后，每孔加MTT溶液20 L。继续孵育4 h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加150 L的DMSO溶液，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，酶标仪（BioTek ELx800）读取各孔光吸收值，记录结果。计算化合物的IC50值[6]。

2 结果与分析

2.1 海南黄芩挥发油成分

本实验利用水蒸气蒸馏法制备海南黄芩挥发油得到特殊香气的浅黄色油状物。用毛细管色谱法对挥发油样品进行测定，GC共分析出71个峰，通过色谱峰面积归一化法测得挥发油中各组分的相对百分含量[4]，根据GC-MS联用所得的质谱信息，经用标准质谱检索库计算机检索，共鉴定出54个化学成分，占挥发油总质量的90.42%。其主要成分为10S，11S-雪松醛-3（12），4-二烯（15.3%）、石竹烯（7.92%）、邻苯二甲酸单乙基己基酯（6.99%）和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（6.54%）（表1）。

2.2 海南黄芩挥发油抗菌结果与分析

目前，针对黄芩属植物挥发油抗菌活性研究较少，但均表现出很好的抑制活性。如：Charu C. Pant等[7]对Scutellaria grossa的挥发油进行抗菌活性测试，发现其对革兰氏阳性菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、革兰氏阴性菌、肺炎克雷伯菌和沙门氏菌有显著的抑制活性；Anan d B. Melkani等[8]对Scutellaria repens进行研究，发现其挥发油对大肠杆菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌有显著的抑制活性。因此，本实验利用微量稀释法对海南黄芩挥发油抑菌活性进行研究，然而，发现其对白色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌等7种细菌未显示抑制活性，MIC值均大于20 μg/mL。测试结果见表2。

2.3 海南黄芩挥发油抗肿瘤结果与分析

目前，鲜见关于黄芩属植物挥发油的抗肿瘤活性测试的报道。本实验采用MTT比色法对挥发油进行抗肿瘤活性研究，发现其对宫颈癌（Hela）和肺腺癌（A549）2种细胞株具有较好的抑制活性，IC50值分别为36.56和29.21 μg/mL 。

3 讨论与结论

本实验通过对海南黄芩的挥发油成分进行研究，分析出71个峰，并鉴别出了其中的54个成分，占挥发油总量的90.42%。其中主要成分为10S，11S-雪松醛-3（12），4-二烯（15.30%）、石竹烯（7.92%）、邻苯二酸单乙基己基酯（6.99%）和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（6.54%）等。药理活性实验结果表明，海南黄芩挥发油未显示抗菌活性，而对宫颈癌（Hela）和肺腺癌（A549）2种细胞株有较好的抑制活性，IC50值分别为36.56和29.21 μg/mL。

在海南黄芩的挥发油的主要成分中，石竹烯（含量为7.92%）对皮肤炎症及消化系统溃疡有较好的疗效，具有抗氧化作用[9]，广泛应用于香料、食品工业、和药物合成中间体等领域。因此，可以考虑将海南黄芩挥发油作为食品的抗氧化剂，当然其在食品贮藏期间的稳定性有待进一步研究。将海南黄芩挥发油与张福维等[10]报道的黄芩地上部分挥发性物质成分和巩江等[11]报道的半枝莲挥发性成分进行比较，同属的3种植物挥发性物质的组成和含量有较大的差异。本实验为黄芩、半枝莲和海南黄芩3种药用植物的中药标准提供了理论依据。

参考文献

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[2] 厍士芳. 黄芩属植物的药用价值研究[J]. 中医药信息，2012，29（3）： 139-142.

[3] 杨小波. 海南植物名录[M]. 北京：科学出版社，2013：391.

[4] 孙慧玲，王俊霞，顾雪竹，等. 山胡椒叶及果实挥发性成分分[J]. 中国实验方剂学杂志，2011，17（7）： 94-97.

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[6] 苏秀莉，卢卫红，张 浩，等. MTT法检测香叶木苷对脐静脉内皮细胞增殖抑制的影响[J]. 中国医药信息，2012，29（6）：101-104.

[7] Charu C P， Anand B M， Lalit M， et al. Composition and antibacterial activity of essential oil from Scutellaria grossa Wall ex Benth[J]. Natural Product Research 2012， 26（2）： 190-192.

[8] Anan d B M， Manoj N， Lalit M，et al. Steam volatile oil from Scutellaria repens Buch-Ham. ex D. Don； its composition and antibacterial activity[J]. The Journal of Essential Oil Research， 2013， 25（5）： 368-371.

[9] Leopold J， Gerhard B， Albena S， et al. Composition quality control and antmicrobial activity of the essential oil of long time Dill seeds from Bulgaria[J]. Chemistry of Natural Compounds， 2003， 51： 3 854-3 857.

[10] 张福维，回瑞华，侯冬岩，等. 半枝莲挥发性化学成分分析[J]. 质谱学报，2009，30（3）：175-178.

[11] 巩 江，倪士峰，刘阳子，等. 黄芩地上部分挥发性物质气相色谱—质谱研究[J]. 安徽农业科学，2009，37（32）：15 844-15 845.