巴西橡胶树β—木糖苷酶基因的克隆与生物信息学分析

古小玲++涂敏

摘 要 以巴西橡胶树根为材料，利用RT-PCR技术从总RNA中捕获到一个β-木糖苷酶家族基因（β-xylosidase 或β-D-xyloside xylohydrolase，EC 3.2.1.37），cDNA长度2 880 bp，开放阅读框2 319 bp，编码773个氨基酸，命名为HbEC32。在HbEC32氨基酸序列中具有一个较强的跨膜区，二级结构分析表明其属于混合型蛋白。HbEC32在N端前8～20氨基酸区域内为较强的疏水区，但整条多肽链表现为亲水性。对15个β-木糖苷酶蛋白进行系统进化分析发现，巴西橡胶树的HbEC32基因与蓖麻亲缘关系最近。

关键词 巴西橡胶树 ；HbEC32 ；基因克隆 ；序列分析

分类号 S794.1

橡胶产业面临着多种病虫害的危害，橡胶树根病是其中的一类重要土传性病害[1]。此类病害主要是由担子菌和子囊菌中不同种的真菌危害巴西根系而造成，首先影响橡胶树的生长，引起叶片发黄、树枝缺水干枯，降低胶乳产量，最后直接导致整株树死亡，造成巨大的经济损失[2-3]。目前研究表明，在植物与病原菌互作中，病原菌形成一系列入侵、快速生长、迅速扩散的机制；而植物细胞形成了含有大量的纤维素、半纤维素和木质素的细胞壁，形成了坚固的壁垒[4]。其中，木聚糖酶是其入侵寄主植物的物质基础之一，植物木聚糖酶主要包括外切β-1，4-木聚糖酶、内切β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶[5]。笔者在橡胶树根中克隆到橡胶树β-木糖苷酶相关基因，为橡胶树木聚糖酶。深入对橡胶树β-木糖苷酶基因进行研究，了解橡胶树β-木糖苷酶在受根病病原菌侵染时的表达水平，是否存在表达相关的抑制性蛋白，对研究橡胶树根病防治和抗根病具有重要意义。本研究以巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）嫩根为材料，通过比较分析多种植物的β-木糖苷酶基因的保守序列，设计特异引物，采用RT-PCR的方法获得了HbEC32完整开放阅读框序列，从而为橡胶树根病致病机理研究和橡胶树抗根病分子育种奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

树根：巴西橡胶树热研7-33-97品系的组培苗的幼嫩根，由中国热带农业科学院橡胶研究所国家种质资源圃提供。

试剂：高保真Taq酶、T4 DNA连接酶、RNA酶抑制剂、pMD19-T载体（大连宝生物公司），反转录试剂盒（Fermentas公司），感受态细胞菌种为Escherichia coli JM109（北京全式金生物技术有限公司），DNA凝胶和PCR产物回收试剂盒（Axygen公司）。

引物合成与测序送深圳华大完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA第一链的合成

采用改良的CTAB法[3]提取巴西橡胶树热研7-33-97品系组培苗嫩根的总RNA。根据反转录试剂盒说明，取1 μg总RNA进行cDNA第一链的合成，具体操作按产品说明书进行。

1.2.2 HbEC32的克隆与序列测定

从NCBI网站获取已发表的人参、番茄、蓖麻、葡萄等作物[6-9]的β-木糖苷酶基因序列，通过生物信息学分析软件，进行同源性比对，利用保守区域的序列设计引物，正向引物5′-GTTTGTTAGCTCTTTACTCTCTATCAAC-3′反向引物5′-TGGGAGTATGAAAAAAA TAATAATAAT-3′，采用RT-PCR技术进行基因克隆，获取基因开放阅读框完整序列。以1.2.1获得的cDNA第一链为模板50 ng，进行PCR扩增，扩增体系为20 μL。扩增程序为：95℃变性5 min，94℃变性30 S，58℃退火30 S，72℃延伸2.5 min，30个循环，最后72 ℃延伸15 min。利用1.0%琼脂糖凝胶，电泳分离PCR扩增产物，在紫外灯下回收目的条带；利用DNA凝胶和PCR产物回收试剂盒进行纯化回收，回收的目的片段克隆到载体pMD19-T，转化到大肠杆菌JM109中，筛选阳性菌株送测序。

1.2.3 HbEC32基因生物信息学分析

对以获得的基因序列进行相关的生物信息学分析。通过DNAMAN软件对目的基因开放阅读框的预测、以及蛋白的基本性质进行分析；利用NCBI序列比对分析目的基因的氨基酸保守结构域；利用Predict Protein、TMpred和ServerProtScale在线蛋白质分析软件分析HbEC32蛋白的二级结构、跨膜方向、蛋白质跨膜区、疏水性和亲水性；利用Clustal X 1.83软件对15个不同来源的β-木糖苷酶相关基因进行系统进化分析。

2 结果与分析

2.1 RNA与反转录cDNA的检测

电泳结果表明，通过改良的CTAB法提取的橡胶树幼嫩根RNA完整性很好（图1）。由图1可以看出，28 S条带比18 S条带亮2倍，无拖尾；A260/A280比值在1.80～2.0，提取的RNA纯度达到反转录cDNA要求；反转录cDNA的扩增产物在1 100 bp左右，条带清晰、亮度适中（图2），提取的RNA反转录成cDNA质量较好，可用于后续的基因扩增。

2.2 HbEC32的RT-PCR扩增

1.0%琼脂糖凝胶上电泳结果显示，4个重复泳道，都出现清晰的唯一条带，对比Marker，大小在3 000 bp左右的地方（图3），PCR扩增产物与引物设计的目的片段的分子量大小相一致，可以用于下一步回收、连接、转化送测序。

2.3 HbEC32的序列分析

DNAMAN软件对目的基因测序分析表明，获得的HbEC32基因长度2 880 bp，开放阅读框2 319 bp，编码氨基酸773个（图4），分子量约为85.15 ku，理论等电点为7.90。通过NCBI比对结果来知，目标蛋白与糖基水解酶家族和木糖糖苷酶有很高的同源性（图5）。HbEC32蛋白的二级结构预测结果中，α螺旋（H）占25.90%，β折叠（E）占15.80%，无规则卷曲（L）占58.30%，预测HbEC32蛋白属于混合型蛋白（图6）。endprint

2.4 HbEC32蛋白的亲水性/疏水性分析

巴西橡胶树HbEC32蛋白的疏水性/亲水性在线预测结果表明：HbEC32蛋白多肽链在第15位表现出最强的疏水性，分值为2.78；在第710位表现出最强的亲水性，分值为-2.94；N端前8～20氨基酸范围内有一较强的疏水区；总体来说，此多肽链表现出较强的亲水性（图7）。

2.5 HbEC32蛋白跨膜区分析

TMpred进行蛋白质跨膜区和跨膜方向的预测结果表明，HbEC32蛋白氨基酸序列中3～24和524～544处出现分值1367和561的跨膜结构域，属可溶性型、可跨膜蛋白类（图8），这一结果与ProtScale预测的HbEC32蛋白多肽链表现为亲水性一致。

2.6 HbEC32基因的进化分析

利用Clustal X 1.83软件对HbEC32基因进行系统进化分析，结果显示：15个β-木糖苷酶基因可分为2大类，可可的β-木糖苷酶基因家族4号基因与其它的进化距离较大，其他物种和橡胶树HbEC32归为一类，其中蓖麻和橡胶树进化距离最近（图9）。

说明：15个β-木糖苷酶基因：橡胶树（Hb）、蓖麻（Rc）、毛杨（Pt）、可可（Tc1、Tc2、Tc3、Tc4）、甜橙（Cs）、野草莓（Fv）、葡萄（Vv）、拟南芥（At3、At7）、马铃薯（St）、碧桃（Pp）、鹰嘴豆（Ca）。

3 讨论与结论

在植物与病原菌互作中，分泌细胞壁降解酶是病原菌的一种入侵机制[10]。而寄主植物为防御病原菌的侵入，一方面主动识别病原菌木聚糖酶，使木聚糖酶作为激发子引发宿主的一系列防卫反应[11]，另一方面，寄主植物通过合成木聚糖酶抑制蛋白来抑制病原菌木聚糖酶的活性，产生防御效果[12]。寄主植物的抑制蛋白会根据病原菌的木聚糖酶的不同而形成一系列结构、表达模式、作用特异性等特征各异的家族成员，而且这种变化常常是由很少数的几个氨基酸残基的结构决定的[13]。

目前，橡胶树的木聚糖酶家族基因的研究还比较少，而橡胶树中真菌病害却比较多。本研究从橡胶树根中分离得到的β-木糖苷酶基因是木聚糖酶庞大家族的一员，推测对于橡胶树根病病原菌来说，木聚糖酶可能是其入侵寄主植物的物质基础，与橡胶树的细胞壁合成和病原菌防御有着密切的关系。但确定其是否能够影响橡胶树的抗病性，还需后续进一步进行功能和表达分析的研究。本研究获得的橡胶树β-木糖苷酶基因将为橡胶树根病防治和抗根病研究奠定一定的分子理论基础。

致 谢 感谢中国热带农业科学院橡胶研究所国家天然橡胶种质资源圃提供巴西橡胶树品系热研7-33-97的树根材料。

参考文献

[1] 黄宗道. 热带北缘橡胶树栽培[M]. 广州：广东科技出版社，1987.

[2] 黄贵修，许灿光. 中国天然橡胶病虫草害识别与防治[M]. 北京：中国农业出版社，2012.

[3] 安泽伟，黄 华. 一种提取橡胶树叶中总DNA的方法[J]. 植物生理学通讯，2005（4）：513-515.

[4] 黄宗庆. 木糖苷酶的酶学性质分析及定向进化[D]. 武汉：华中农业大学，2013.

[5] 郑 莉，杨金玲，朱 平，等. β-木糖苷酶的研究进展[J]. 浙江林业科技，2005（1）：60-65.

[6] 张春枝. 人参皂苷糖基水解酶的研究[D]. 大连：大连理工大学，2002.

[7] Itai A， Ishihara K， Bewley D. Characterization of expression， and cloning， of β-d-xylosidase and α-L-arabinofuranosidase in developing and ripening tomato （Lycopersicon esculentum Mill.） fruit[J]. Exp Bot， 2003， 54： 2 615-2 622.

[8] Ronen R， Zauberman G， Akerman M， et al. Xylanase and xylosidase activities in avocado fruit[J]. Plant Physiol，1991，95（3）：961-964.

[9] Minic Z， Rihouey C， Cao T Do， et al. Purification and characterization of enzymes exhibiting β-d-xylosidase activities in stem tissues of Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2004， 135（2）：867-878.

[10] Yejun Han，Hongzhang Chen. A β-xylosidase from cell wall of maize： Purification， properties and its use in hydrolysis of plant cell wall[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic， 2010， 63（3-4）： 135-140.

[11] 王 瑾. 茶树叶部由病原真菌侵染引发的内源糖苷酶及咖啡碱合成相关酶基因差异表达[D]. 合肥：安徽农业大学，2011.

[12] 周 洁，郑祥梓，兰 斓，等. 稻瘟病菌假定的糖基水解酶62家族初步研究[J]. 中国农业科学，2009（8）：2 754-2 762.

[13] Claudia A，Bustamante，Pedro M Civello，et al. Cloning of the promoter region of β-xylosidase （FaXyl1） gene and effect of plant growth regulators on the expression of FaXyl1in strawberry fruit[J]. Plant Science， 2009， 177： 49-56.endprint

2.4 HbEC32蛋白的亲水性/疏水性分析

巴西橡胶树HbEC32蛋白的疏水性/亲水性在线预测结果表明：HbEC32蛋白多肽链在第15位表现出最强的疏水性，分值为2.78；在第710位表现出最强的亲水性，分值为-2.94；N端前8～20氨基酸范围内有一较强的疏水区；总体来说，此多肽链表现出较强的亲水性（图7）。

2.5 HbEC32蛋白跨膜区分析

TMpred进行蛋白质跨膜区和跨膜方向的预测结果表明，HbEC32蛋白氨基酸序列中3～24和524～544处出现分值1367和561的跨膜结构域，属可溶性型、可跨膜蛋白类（图8），这一结果与ProtScale预测的HbEC32蛋白多肽链表现为亲水性一致。

2.6 HbEC32基因的进化分析

利用Clustal X 1.83软件对HbEC32基因进行系统进化分析，结果显示：15个β-木糖苷酶基因可分为2大类，可可的β-木糖苷酶基因家族4号基因与其它的进化距离较大，其他物种和橡胶树HbEC32归为一类，其中蓖麻和橡胶树进化距离最近（图9）。

说明：15个β-木糖苷酶基因：橡胶树（Hb）、蓖麻（Rc）、毛杨（Pt）、可可（Tc1、Tc2、Tc3、Tc4）、甜橙（Cs）、野草莓（Fv）、葡萄（Vv）、拟南芥（At3、At7）、马铃薯（St）、碧桃（Pp）、鹰嘴豆（Ca）。

3 讨论与结论

在植物与病原菌互作中，分泌细胞壁降解酶是病原菌的一种入侵机制[10]。而寄主植物为防御病原菌的侵入，一方面主动识别病原菌木聚糖酶，使木聚糖酶作为激发子引发宿主的一系列防卫反应[11]，另一方面，寄主植物通过合成木聚糖酶抑制蛋白来抑制病原菌木聚糖酶的活性，产生防御效果[12]。寄主植物的抑制蛋白会根据病原菌的木聚糖酶的不同而形成一系列结构、表达模式、作用特异性等特征各异的家族成员，而且这种变化常常是由很少数的几个氨基酸残基的结构决定的[13]。

目前，橡胶树的木聚糖酶家族基因的研究还比较少，而橡胶树中真菌病害却比较多。本研究从橡胶树根中分离得到的β-木糖苷酶基因是木聚糖酶庞大家族的一员，推测对于橡胶树根病病原菌来说，木聚糖酶可能是其入侵寄主植物的物质基础，与橡胶树的细胞壁合成和病原菌防御有着密切的关系。但确定其是否能够影响橡胶树的抗病性，还需后续进一步进行功能和表达分析的研究。本研究获得的橡胶树β-木糖苷酶基因将为橡胶树根病防治和抗根病研究奠定一定的分子理论基础。

致 谢 感谢中国热带农业科学院橡胶研究所国家天然橡胶种质资源圃提供巴西橡胶树品系热研7-33-97的树根材料。

参考文献

[1] 黄宗道. 热带北缘橡胶树栽培[M]. 广州：广东科技出版社，1987.

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[8] Ronen R， Zauberman G， Akerman M， et al. Xylanase and xylosidase activities in avocado fruit[J]. Plant Physiol，1991，95（3）：961-964.

[9] Minic Z， Rihouey C， Cao T Do， et al. Purification and characterization of enzymes exhibiting β-d-xylosidase activities in stem tissues of Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2004， 135（2）：867-878.

[10] Yejun Han，Hongzhang Chen. A β-xylosidase from cell wall of maize： Purification， properties and its use in hydrolysis of plant cell wall[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic， 2010， 63（3-4）： 135-140.

[11] 王 瑾. 茶树叶部由病原真菌侵染引发的内源糖苷酶及咖啡碱合成相关酶基因差异表达[D]. 合肥：安徽农业大学，2011.

[12] 周 洁，郑祥梓，兰 斓，等. 稻瘟病菌假定的糖基水解酶62家族初步研究[J]. 中国农业科学，2009（8）：2 754-2 762.

[13] Claudia A，Bustamante，Pedro M Civello，et al. Cloning of the promoter region of β-xylosidase （FaXyl1） gene and effect of plant growth regulators on the expression of FaXyl1in strawberry fruit[J]. Plant Science， 2009， 177： 49-56.endprint

2.4 HbEC32蛋白的亲水性/疏水性分析

巴西橡胶树HbEC32蛋白的疏水性/亲水性在线预测结果表明：HbEC32蛋白多肽链在第15位表现出最强的疏水性，分值为2.78；在第710位表现出最强的亲水性，分值为-2.94；N端前8～20氨基酸范围内有一较强的疏水区；总体来说，此多肽链表现出较强的亲水性（图7）。

2.5 HbEC32蛋白跨膜区分析

TMpred进行蛋白质跨膜区和跨膜方向的预测结果表明，HbEC32蛋白氨基酸序列中3～24和524～544处出现分值1367和561的跨膜结构域，属可溶性型、可跨膜蛋白类（图8），这一结果与ProtScale预测的HbEC32蛋白多肽链表现为亲水性一致。

2.6 HbEC32基因的进化分析

利用Clustal X 1.83软件对HbEC32基因进行系统进化分析，结果显示：15个β-木糖苷酶基因可分为2大类，可可的β-木糖苷酶基因家族4号基因与其它的进化距离较大，其他物种和橡胶树HbEC32归为一类，其中蓖麻和橡胶树进化距离最近（图9）。

说明：15个β-木糖苷酶基因：橡胶树（Hb）、蓖麻（Rc）、毛杨（Pt）、可可（Tc1、Tc2、Tc3、Tc4）、甜橙（Cs）、野草莓（Fv）、葡萄（Vv）、拟南芥（At3、At7）、马铃薯（St）、碧桃（Pp）、鹰嘴豆（Ca）。

3 讨论与结论

在植物与病原菌互作中，分泌细胞壁降解酶是病原菌的一种入侵机制[10]。而寄主植物为防御病原菌的侵入，一方面主动识别病原菌木聚糖酶，使木聚糖酶作为激发子引发宿主的一系列防卫反应[11]，另一方面，寄主植物通过合成木聚糖酶抑制蛋白来抑制病原菌木聚糖酶的活性，产生防御效果[12]。寄主植物的抑制蛋白会根据病原菌的木聚糖酶的不同而形成一系列结构、表达模式、作用特异性等特征各异的家族成员，而且这种变化常常是由很少数的几个氨基酸残基的结构决定的[13]。

目前，橡胶树的木聚糖酶家族基因的研究还比较少，而橡胶树中真菌病害却比较多。本研究从橡胶树根中分离得到的β-木糖苷酶基因是木聚糖酶庞大家族的一员，推测对于橡胶树根病病原菌来说，木聚糖酶可能是其入侵寄主植物的物质基础，与橡胶树的细胞壁合成和病原菌防御有着密切的关系。但确定其是否能够影响橡胶树的抗病性，还需后续进一步进行功能和表达分析的研究。本研究获得的橡胶树β-木糖苷酶基因将为橡胶树根病防治和抗根病研究奠定一定的分子理论基础。

致 谢 感谢中国热带农业科学院橡胶研究所国家天然橡胶种质资源圃提供巴西橡胶树品系热研7-33-97的树根材料。

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[7] Itai A， Ishihara K， Bewley D. Characterization of expression， and cloning， of β-d-xylosidase and α-L-arabinofuranosidase in developing and ripening tomato （Lycopersicon esculentum Mill.） fruit[J]. Exp Bot， 2003， 54： 2 615-2 622.

[8] Ronen R， Zauberman G， Akerman M， et al. Xylanase and xylosidase activities in avocado fruit[J]. Plant Physiol，1991，95（3）：961-964.

[9] Minic Z， Rihouey C， Cao T Do， et al. Purification and characterization of enzymes exhibiting β-d-xylosidase activities in stem tissues of Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2004， 135（2）：867-878.

[10] Yejun Han，Hongzhang Chen. A β-xylosidase from cell wall of maize： Purification， properties and its use in hydrolysis of plant cell wall[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic， 2010， 63（3-4）： 135-140.

[11] 王 瑾. 茶树叶部由病原真菌侵染引发的内源糖苷酶及咖啡碱合成相关酶基因差异表达[D]. 合肥：安徽农业大学，2011.

[12] 周 洁，郑祥梓，兰 斓，等. 稻瘟病菌假定的糖基水解酶62家族初步研究[J]. 中国农业科学，2009（8）：2 754-2 762.

[13] Claudia A，Bustamante，Pedro M Civello，et al. Cloning of the promoter region of β-xylosidase （FaXyl1） gene and effect of plant growth regulators on the expression of FaXyl1in strawberry fruit[J]. Plant Science， 2009， 177： 49-56.endprint