一株来自红树林土壤的利普斯他汀产生菌的分离鉴定与发酵特性初步研究

赵培静++缪承杜++梁淑娃++夏枫耿

摘 要 从红树林土壤中筛选到一株产利普斯他汀（Lipstatin）的菌株GWL1.2012，通过形态特征、生理生化及16S rDNA序列分析，对该菌进行鉴定。结果显示，菌株GWL1.2012与毒三素链霉菌形成一个类群，同源性高达99.7%，故将其鉴定为毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini），并对菌株GWL1.2012发酵特性进行初步研究，为以后的产业化开发生产提供参考依据。

关键词 红树林 ；链霉菌 ；鉴定 ；利普斯他汀 ；发酵

分类号 Q939.1

肥胖是全球成年人最大的慢性疾病，被世界卫生组织（WHO）明确认定为导致疾病发生的十大危险因素之一。治疗和遏制肥胖已成为全球医学攻关的重要内容。主要有食欲抑制剂、产热剂、消化吸收阻滞剂、激素调控剂等四大类数十种药物。微生物发酵产生的利普司他汀（Lipstatin）能选择性抑制胃肠道中胰脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收。其四氢衍生物奥利司他（Orlistat）被成功开发为新型减肥药物[1]，是目前作为非中枢神经系统作用的唯一一个治疗肥胖症的药物[2]。研究表明，奥利司他非全身作用、具有良好耐受性和有效性，不用食欲抑制剂而治疗肥胖，为肥胖症的药物治疗开辟了新途径[3]。

本研究对广东湛江红树林土壤进行选择性分离，并从中筛选分离到新型减肥药物奥利司他前体物质尼泊司他汀产生菌菌株，对活性菌株进行了分类鉴定及发酵的初步研究，旨在发掘具有潜在应用前景的新型减肥活性药物菌株，为进一步开发利用海洋来源的新型药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样

2013年秋季，通过多点取样法从广东湛江红树林淤泥土中采集土样。

1.1.2 培养基

固体培养基：高氏培养基、燕麦片琼脂培养基[4]。

发酵培养基：甘油（1.5%），胰蛋白胨（2.0%），豆油（4%），燕麦粉（0.8%），ZnSO4（0.01%）， CaCO3（0.5%），复合乳化剂（0.05%），装量80 mL/500 mL锥形烧瓶，将菌株接种到发酵培养基中，30℃，200 r/min，培养7 d，观察其发酵情况，检测发酵产物。

1.2 菌株的分离及鉴定

1.2.1 菌株分离

对采集到的红树林淤泥进行选择性微生物分离，采用以豆油为唯一碳源的改良燕麦琼脂培养基进行菌株分离[5-6]。涂布于含不同浓度豆油的分离平板上，培养观察生长状况，代谢产物经色谱分析确认，获得放线菌菌株GWL1.2012，菌株保藏于广东省微生物种质资源库。

1.2.2 形态观察

将分离得到的菌株分别接种到固体平板上插片培养，30℃培养7～10 d，每24 h观察菌落形态，并进行革兰氏染色观察细胞形态。

1.2.3 生理生化特征观察

参照《伯杰氏系统细菌学手册》（第九版）[7]和《链霉菌鉴定手册》[8]进行生理生化特征的测定观察。

1.2.4 16S rRNA 基因扩增、测序与构建系统发育树

以实验室已有16S rRNA 基因通用引物，对分离菌株进行菌落PCR扩增 16S rDNA，正向引物，27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物，1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增总体积50 μL，94℃预变性30min，94℃变性1 min，60℃ 退火0.5 min， 72℃延伸1.5 min，进行30个循环，72℃延伸10 min。用上海生工DNA纯化回收试剂盒对PCR产物进行回收，与 pMD18-T 载体连接，送由上海英骏生物技术有限公司完成测序。从Genbank数据库中获取与分离菌株亲源关系较近的模式菌株核糖体基因16S（16S rRNA基因）区域序列，结合在GenBank中经BLAST 获取到的菌株16SrRNA基因，运用MEGA4.1软件模型，采用邻接法（NJ） 构建系统发育树（Replications=1000，Bootstrap值取百分比）。

1.3 摇瓶发酵

1.3.1 发酵培养

将菌株GWL1.2012接种到发酵培养基中，接种量10%，30℃，220 r/min，培养192 h，每12 h取样检测，每批3个重复，取其平均值，绘制pH变化和湿重变化曲线。

1.3.2 尼泊司他汀活性测定

菌株发酵粗提物制备 参考Janos[9]方法，菌株192 h后结束发酵培养。取发酵液高速冷冻离心（10 000 r/min，18℃，10 min） ，取菌体，将菌体于细胞破碎仪破碎，离心后取上清，作为提取粗体样品，备用。

产物测定通过HPLC方法与标准品进行标定分析[10]。

2 结果与分析

通过对采集到的红树林淤泥进行选择性微生物分离，获得高产利普斯他汀的放线菌菌株GWL1.201，进一步对该菌株进行分类鉴定和发酵初步研究。

2.1 形态特征

菌株GWL1.2012在固体平板上培养10 d的菌落形态特征：菌落粉状，肉粉色至粉灰色，产生大量孢子，褐色可溶色素，见图1。显微特征为基内菌丝无色，气生菌丝分叉较多，松散螺旋状、柔曲，产孢，孢子椭圆形，表面光滑，见图2。

根据《伯杰氏系统细菌学手册》比对分析，发现该菌株GWL1.2012在固体平板上的生长状态、显微形态特征，与链霉菌属菌株相似，可将其归属为链霉菌。

2.1.2 生理生化特征

进一步对菌株GWL1.2012进行部分生理生化鉴定，结果见表1。

根据《链霉菌鉴定手册》进行生理生化的检endprint

测与比对分析，发现该菌株GWL1.2012的生化特征与毒三素链霉菌特征相一致，可初步鉴定为毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）。

2.1.3 系统发育树的构建与分析

菌株GWL1.2012的核糖体基因中的16S区域经测序，长度为1 437 bp，通过BLAST与GenBank数据库相关序列比对，构建系统发育树，见图3。结果显示该序列与Streptomyces toxytricini相似性最高，为99.7%。根据放线菌16SrDNA序列在分类鉴定中的划分依据，大于99%即可归为同一个种，可将其鉴定为毒三素链霉菌。

结合GWL1.2012的生长形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析结果，菌株GWL1.2012鉴定为毒三素链霉菌。

2.2 摇瓶发酵初步研究

菌株GWL1.2012菌体湿重随培养时间逐渐增加，0～48 h为生长迟缓期，48 h后开始增长加快，进入生长对数期， 60～144 h菌种生长进入稳定期，随着培养时间的延长繁殖速度渐减，死亡数逐渐增加进入衰亡期；从发酵开始速效碳源被快速利用pH稍有降低，24 h起开始利用迟效碳源pH逐渐上升，60～144 h菌体生长阶段维持在6.7～6.9，之后随菌体也溶解衰亡pH一直升高到7.3以上，结合菌体湿重生长状态基本一致，见图4。

2.3 发酵产物尼泊司他汀测定

同时通过对其发酵过程的检测数据分析发现，发酵60 h左右时，产物Lipstatin开始生成，随着菌株进入稳定生长期而逐渐增加，到发酵结束时浓度达到最大值为1 900 mg/L，见图5。

3 结论与讨论

本研究对采集到的红树林淤泥进行选择性微生物分离，获得高产利普斯他汀的放线菌菌株GWL1.2012，也是国内首次报道由红树林淤泥分离得到产lipstatin的菌株；通过培养生长形态特征、生理生化特性研究以及16S rDNA 的基因序列分析比对，GWL1.2012鉴定为毒三素链霉菌；对菌株的发酵代谢过程及产物进行了初步研究，发酵水平达到1 900 mg/L，领先国内已有文献报道水平；微生物来源的酶抑制剂是一类重要的微生物次级代谢产物，也成为了新型减肥药物开发的重要途径。菌株GWL1.2012能产生活性较强的脂肪酶抑制代谢产物利普斯他汀，将进一步对其进行发酵优化及代谢产物深入研究， 有望开发为新型的减肥药物。

参考文献

[1] MELIA A T， Zh I J， ZE I R， et al. The interact ion of the liposeinhibitor orlistat with ethanol in healthy volunteers[J]. Eur J Clin Pharmacol， 1998， 54（9-10）： 773-775.

[2] Hollander P A， Elbein S C， Hirsch I B， et al. Role of orlistat in the treatment of obese patients with type 2 diabetes[J] . DIABET ES CARE， 1998， 21（8）： 1 288-1 289.

[3] 马 微，付 丽，等.新型减肥药奥利司他的研究进展[J]. 华西药学杂志，2009，24（4）：431-433.

[4] Waksman S A. Classification， identification and description of genera and species [A]， In The Actinomycetes[M]. Vol. Ⅱ. Baltimore： The Williams and Wilkins， Co.1961： 328.

[5] M arkus G， Wo lfg ang E， Adelber t B， et al. Biosynthesis origin of hydrogen atoms in the lipase inhibitor lipstatin[J]. J Biol Chem， 2000， 275（28） ： 21192

[6] M arkus G， Wo lfg ang E， Adelber t B， et al. Biosynthesis of lipstatin [J] . J Org Chem， 2001， 66（13）： 4668

[7] John G H， Bergey D H， Noel R K. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology（9th Revised edition[M].

[8] Group of Actinomycetes Taxonomy of Institute of Microbiology of Chinese Academy of Sciences.Streptomyces identification manual（ in Chinese）[M].Beijing：Science Press（北京：科学出版社）， 1975.

[9] Janos E， Eva G， Gabor B， et al. Fermentation process for lipstatin and method of extracting lipstatin from a fermentation broth： US， 6844174[P]. 2005-01-18.

[10] 胡为民，庄英萍，王永红，等. 毒三素链霉菌生产利普司他汀的发酵与提取工艺[J]. 中国医药工业杂志，2007，38（10）：705-708.endprint

测与比对分析，发现该菌株GWL1.2012的生化特征与毒三素链霉菌特征相一致，可初步鉴定为毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）。

2.1.3 系统发育树的构建与分析

菌株GWL1.2012的核糖体基因中的16S区域经测序，长度为1 437 bp，通过BLAST与GenBank数据库相关序列比对，构建系统发育树，见图3。结果显示该序列与Streptomyces toxytricini相似性最高，为99.7%。根据放线菌16SrDNA序列在分类鉴定中的划分依据，大于99%即可归为同一个种，可将其鉴定为毒三素链霉菌。

结合GWL1.2012的生长形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析结果，菌株GWL1.2012鉴定为毒三素链霉菌。

2.2 摇瓶发酵初步研究

菌株GWL1.2012菌体湿重随培养时间逐渐增加，0～48 h为生长迟缓期，48 h后开始增长加快，进入生长对数期， 60～144 h菌种生长进入稳定期，随着培养时间的延长繁殖速度渐减，死亡数逐渐增加进入衰亡期；从发酵开始速效碳源被快速利用pH稍有降低，24 h起开始利用迟效碳源pH逐渐上升，60～144 h菌体生长阶段维持在6.7～6.9，之后随菌体也溶解衰亡pH一直升高到7.3以上，结合菌体湿重生长状态基本一致，见图4。

2.3 发酵产物尼泊司他汀测定

同时通过对其发酵过程的检测数据分析发现，发酵60 h左右时，产物Lipstatin开始生成，随着菌株进入稳定生长期而逐渐增加，到发酵结束时浓度达到最大值为1 900 mg/L，见图5。

3 结论与讨论

本研究对采集到的红树林淤泥进行选择性微生物分离，获得高产利普斯他汀的放线菌菌株GWL1.2012，也是国内首次报道由红树林淤泥分离得到产lipstatin的菌株；通过培养生长形态特征、生理生化特性研究以及16S rDNA 的基因序列分析比对，GWL1.2012鉴定为毒三素链霉菌；对菌株的发酵代谢过程及产物进行了初步研究，发酵水平达到1 900 mg/L，领先国内已有文献报道水平；微生物来源的酶抑制剂是一类重要的微生物次级代谢产物，也成为了新型减肥药物开发的重要途径。菌株GWL1.2012能产生活性较强的脂肪酶抑制代谢产物利普斯他汀，将进一步对其进行发酵优化及代谢产物深入研究， 有望开发为新型的减肥药物。

参考文献

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[10] 胡为民，庄英萍，王永红，等. 毒三素链霉菌生产利普司他汀的发酵与提取工艺[J]. 中国医药工业杂志，2007，38（10）：705-708.endprint

测与比对分析，发现该菌株GWL1.2012的生化特征与毒三素链霉菌特征相一致，可初步鉴定为毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）。

2.1.3 系统发育树的构建与分析

菌株GWL1.2012的核糖体基因中的16S区域经测序，长度为1 437 bp，通过BLAST与GenBank数据库相关序列比对，构建系统发育树，见图3。结果显示该序列与Streptomyces toxytricini相似性最高，为99.7%。根据放线菌16SrDNA序列在分类鉴定中的划分依据，大于99%即可归为同一个种，可将其鉴定为毒三素链霉菌。

结合GWL1.2012的生长形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析结果，菌株GWL1.2012鉴定为毒三素链霉菌。

2.2 摇瓶发酵初步研究

菌株GWL1.2012菌体湿重随培养时间逐渐增加，0～48 h为生长迟缓期，48 h后开始增长加快，进入生长对数期， 60～144 h菌种生长进入稳定期，随着培养时间的延长繁殖速度渐减，死亡数逐渐增加进入衰亡期；从发酵开始速效碳源被快速利用pH稍有降低，24 h起开始利用迟效碳源pH逐渐上升，60～144 h菌体生长阶段维持在6.7～6.9，之后随菌体也溶解衰亡pH一直升高到7.3以上，结合菌体湿重生长状态基本一致，见图4。

2.3 发酵产物尼泊司他汀测定

同时通过对其发酵过程的检测数据分析发现，发酵60 h左右时，产物Lipstatin开始生成，随着菌株进入稳定生长期而逐渐增加，到发酵结束时浓度达到最大值为1 900 mg/L，见图5。

3 结论与讨论

本研究对采集到的红树林淤泥进行选择性微生物分离，获得高产利普斯他汀的放线菌菌株GWL1.2012，也是国内首次报道由红树林淤泥分离得到产lipstatin的菌株；通过培养生长形态特征、生理生化特性研究以及16S rDNA 的基因序列分析比对，GWL1.2012鉴定为毒三素链霉菌；对菌株的发酵代谢过程及产物进行了初步研究，发酵水平达到1 900 mg/L，领先国内已有文献报道水平；微生物来源的酶抑制剂是一类重要的微生物次级代谢产物，也成为了新型减肥药物开发的重要途径。菌株GWL1.2012能产生活性较强的脂肪酶抑制代谢产物利普斯他汀，将进一步对其进行发酵优化及代谢产物深入研究， 有望开发为新型的减肥药物。

参考文献

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[10] 胡为民，庄英萍，王永红，等. 毒三素链霉菌生产利普司他汀的发酵与提取工艺[J]. 中国医药工业杂志，2007，38（10）：705-708.endprint