丙环唑在香蕉及土壤中残留量的检测分析①

吴 琼 王明月 吕岱竹 吴晓春 葛会林

(中国热带农业科学院分析测试中心/农业农村部热作产品质量安全风险评估实验室(海口)/海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室 海南海口571101)

丙环唑是一种既有保护作用又有治疗作用的内吸性三唑类杀菌剂，可被根茎叶部吸收，并很快地在植物体内向上传导。其作用机理是影响甾醇的生物合成，使病原菌的细胞膜功能受到破坏，最终导致细胞死亡，从而起到杀菌、防病和治病的功效。严重的香蕉叶斑病会影响香蕉的产量和品质［1-2］，丙环唑是防治香蕉叶斑病的主要农药品种之一，在香蕉种植过程中被大量施用［3-5］。经查询中国农药信息网，丙环唑在我国登记的作物主要有水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、马铃薯、茭白、莲藕、枇杷、花生、苹果、香蕉、榛子和人参等。CAC 标准中制定的香蕉上丙环唑MRL 为0.1 mg/kg；美国环保总署（EPA）制定的MRL 为0.2 mg/kg；欧盟标准中的MRL 为0.1 mg/kg；日本2015 年实施的“肯定列表制度”对香蕉中丙环唑的限量为0.1 mg/kg；中国标准香蕉中丙环唑的MRL为1 mg/kg［6］。

国内外已报道的丙环唑杀菌剂残留量的检测方法有气相色谱法［7-9］、高效液相色谱法［10］、高效液相-串联质谱法［11-12］等。如：侯志广等［13］应用气相色谱仪测定稻米中丙环唑和咪鲜胺的残留量；徐妍等［14］应用高效液相色谱仪测定丙环唑原药的残留；叶倩等［15］利用QuEChERS法对叶菜进行前处理，再用超高效液相色谱－串联质谱仪测定叶菜中丙环唑的残留量。目前，关于丙环唑的研究多数集中在田间药效和水稻中的残留分析上，对于应用气相色谱质谱法测定香蕉及其土壤中的残留情况目前报道较少。鉴于此，本研究建立了丙环唑在香蕉和土壤中残留及消解动态的气相色谱-质谱分析方法，并于海南和云南两地进行了田间试验，以期为评价丙环唑在香蕉上的安全使用，确保该药的科学合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

（1）供试作物品种：海南省海口市，泰国蕉；云南省玉溪市，巴西蕉。

（2）试验药剂：11.7%丙环唑悬浮剂。

1.1.2 仪器、试剂及标准物质

（1）仪器设备：控温控压全自动旋转蒸发仪，上海豫康科教仪器；氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；离心机，上海安亭科学仪器厂；固相萃取柱Strata Florisil （55 μm，70 A）。

（2）主要试剂及标准物质：无水硫酸钠，分析纯；乙腈和正己烷均为色谱纯；3 mL/500 mg；丙环唑标准品，纯度99.5%，德国DR.Ehrensorfer。

1.2 方法

1.2.1 消解动态试验

按有效成分用药量375 mg a.i/kg（500 倍液）于香蕉生长到成熟个体一半大小时施药，施药时应保证用于动态试验的香蕉均匀着药，于施药后2、24、72、168、336、504、672、1008、1440 h

采样，处理重复3次，处理间设保护隔离区，另设清水空白对照。

1.2.2 最终残留试验

按推荐剂量有效成分丙环唑用药量250 mg a.i/kg（750 倍液），高剂量按有效成分丙环唑用药量375 mg a.i/kg（500 倍液）施药。各设3 次和4 次施药，施药间隔期为10 d，每个处理重复3 次，小区设3棵树。采样时间距离最后一次喷药的间隔时间为28、35、42 d。另设清水空白对照，处理间设保护带。

1.2.3 样品的制备与保存

（1）香蕉全果：田间样本去净表面杂质，剪去果柄，切段放入捣碎机，匀浆混匀，用四分法缩分，分取250 g 样品两份，分别装入样品容器中，贴好实验室样号标签，贮存于-20 ℃冰柜中。

（2）香蕉蕉肉：用刀具纵向将香蕉切分成两瓣，用匙子取出蕉肉放入捣碎机，匀浆混匀用四分法缩分，分取250 g 样品两份，分别装入样品容器中，贴好实验室样品标签。

（3）土壤：田间样本过筛混匀后采用四分法留样500 g 两份，分别装入样品容器中，贴好实验室样号标签，贮存于-20 ℃冰柜中保存。

1.2.4 样品提取

（1） 香蕉全果及蕉肉样品：称取（20.00±0.10）g匀浆后的香蕉样品，置于50 mL 离心管中，加入40.0 mL 乙腈，高速振荡5 min 后，加入约6 g NaCl，继续高速震荡5 min，10 000 r/min离心5 min，准确吸取上清液5.0 mL 于50 mL 圆底烧瓶中，氮吹仪吹干，待净化。

（2）土壤样品：称取（20.00±0.10）g 已过筛的土壤样品，置于100 mL塑料瓶中，加入40.0 mL乙腈，10.0 mL水，在往复式振荡器上振荡提取1 h后加入约6 g NaCl，盖上盖子，剧烈震荡5 min，在室温下静置不少于30 min，准确吸取上清液5.0 mL 于50 mL 圆底烧瓶中，氮吹仪吹干，待净化。

1.2.5 样品净化

在Strata Florisil SPE 小柱中加入适量无水硫酸钠，加样前先分别用3 mL正己烷/丙酮（V/V＝3/7）和3 mL 正己烷预洗柱，当液面到达无水硫酸钠的顶部时，迅速将1.2.4待净化提取液转移至净化柱上，再用3 mL 正己烷/丙酮（V/V＝3/7）洗涤圆底烧瓶3次，并移入柱中洗脱农药，合并于接收瓶中，在40 ℃水浴中旋转浓缩至约0.5 mL，用1.5 mL 正己烷溶剂交换2 次，残留物用正己烷溶解，准确至2.5 mL，待上机。

1.2.6 气相色谱条件

Thermo Trace Ultra，配Thermo RSH Triplus自动进样器，Xcalibur 软件；色谱柱：HP-5MS，0.25 μm，0.25 mm×30 mm；流速：1.0 mL/min；载气：氦气，纯度≥99.999 %；进样量：1 μL；进样口温度：260 ℃；

程序升温：100 ℃，保持1 min，20 ℃/min 升至260 ℃，保持4 min，再以40 ℃/min 升至280 ℃，保持10 min；进样方式：无分流进样，3 min后打开阀。

1.2.7 质谱条件

Thermo DSQII ；电子轰击源：70 eV；电子源温度：250 ℃；GC-MS接口温度：280 ℃。

1.2.8 分析方法

先用SCAN方式对丙环唑进行定性，确定其保留时间（RT）、起始采集时间和定量离子，见表1。

用正己烷配制100 μg/mL 丙环唑标准母液，并用空白基质逐级稀释成0.8、0.16、0.08、0.064、0.032 μg/mL 标准溶液，进样分析，外标法定量。

表1 GC-MS/SIM分析丙环唑残留量的保留时间、开始采集时间和检测离子

2 结果与分析

2.1 标准曲线及仪器检出限

以峰面积（y） 为纵坐标，浓度（0.032～0.80 μg/mL）为横坐标进行回归分析，结果表明，丙环唑在0.032～0.80 μg/mL 呈现出良好的线性关系，标准曲线回归方程为y＝（1.070 53e+007）x-322 718，r2＝0.999 4，见图1；丙环唑最小检出量为2.0×10-3ng。

图1 丙环唑标准曲线

2.2 质谱条件的设定

采用GC/MS 单离子扫描方式进行定性定量分析，图2分别为香蕉全蕉、去皮蕉肉和土壤的空白样品及添加回收样品GC-MS/SIM色谱图。

图2 香蕉全蕉、蕉肉及土壤样品中丙环唑的SIM色谱图

2.3 方法的准确度和精密度

对不含丙环唑的香蕉全蕉、去皮蕉肉及土壤样品，分别添加0.02、0.05、0.5 mg/kg 丙环唑标准品进行添加回收率试验，按照1.2.4 和1.2.5 方法提取、净化；按照1.2.6 和1.2.7 仪器条件进行检测，每个添加水平重复试验5次，同时做空白对照；按照2.1标准曲线进行定量，计算回收率及相对标准偏差，结果见表2。

表2 香蕉全蕉、蕉肉和土壤样品中添加丙环唑的回收率及相对标准偏差（n=5）

由表2 可知，在香蕉全蕉中3 个添加水平的平均添加回收率为85%～101%，相对标准偏差1.4%～3.6%；在去皮蕉肉中3个添加水平的平均添加回收率为89%～95%，相对标准偏差1.3%～3.9%；在土壤中3 个添加水平的平均添加回收率为87%～97%，相对标准偏差5.0%～7.6%。相对标准偏差小于20%，最低检出限为0.02 mg/kg，满足丙环唑农药在香蕉中残留限量的检测要求［6］。

2.4 丙环唑在香蕉全果及土壤中的消解动态

按照1.2 方法进行施药并采集样品进行测定，结果见表3。由表3 可知，丙环唑在香蕉中的消解半衰期为13.6～19.1 d，在土壤中的半衰期为20.4～21.1 d。可以看出，在香蕉果实中的半衰期海南低于云南，在香蕉中的降解速率海南大于云南。试验期间海南海口气温在25～32℃，云南玉溪气温在22～33℃，海南海口与云南元江气温变化幅度基本相同，而丙环唑在香蕉果实中的半衰期是海南海口低于云南元江，分析其原因可能是海南温度和湿度均高于云南，温度的升高使农药粘度降低，扩散速度加快，更容易被微生物活动所利用。

2.5 丙环唑在香蕉全果、蕉肉及土壤中的最终残留量

表3 丙环唑在香蕉和土壤样品中的消解动力学

根据《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763-2016）中丙环唑在植物体内的农药残留物定义为丙环唑［6］，香蕉全果、蕉肉及土壤中丙环唑最终残留量结果见表4。总体上，丙环唑在各基质中残留量从小到大依次为蕉肉＜全果＜土壤，残留量随采收间隔时间的延长而减少。丙环唑在香蕉全果、蕉肉和土壤中的残留量最大值分别为0.069、0.048 和0.628 mg/kg，在香蕉可食部分中丙环唑的残留量远低于中国规定的MRL值1 mg/kg。表明按照推荐剂量在香蕉上使用11.7%丙环唑悬浮剂，距最后一次施用后28 d 以上采收，香蕉是安全的。

表4 丙环唑在香蕉全果、蕉肉与土壤中的最终残留量

3 小结

香蕉中含有丰富的水分、糖及淀粉类物质，采用极性较大的溶剂会使糖及淀粉类物质溶出，影响丙环唑的提取效果。另外，根据JMPR 报告中所述，丙环唑为脂溶性农药，因此本研究选用极性相对较小的乙腈作为提取溶剂，再通过加入NaCl 的方式，使有机相和水相分层，糖、淀粉、水溶性色素及其它杂质随水相分离出去，从而达到初步净化的效果。采用Strata Florisil SPE 小柱对香蕉样品进行净化的过程中，在小柱中添加无水硫酸钠可去除提取液中残留的水相，达到进一步去除杂质的目的。

本研究建立了气相色谱-质谱联用法测定香蕉全果、蕉肉及土壤中丙环唑残留量的检测方法，解决了极性较弱化合物的提取及净化问题，采用基质匹配标准溶液对数据进行校准，解决了质谱中香蕉样品检测的基质效应。本方法操作简单、节省溶剂，且方法的灵敏度、精密度、准确度均符合农药残留分析的要求。丙环唑在海南和云南两地香蕉中的半衰期分别为13.6 和19.1 d，在土壤中的半衰期分别为20.4 和21.1 d。在海南和云南两地的最终残留结果表明，按推荐剂量和1.5倍推荐剂量，对香蕉进行3 次和4 次喷药，末次施药后28、35、42 d 采样，在香蕉全果、蕉肉及土壤中丙环唑的残留量均＜1 mg/kg 的限量值。刘燕菁等［7］研究结果中，广东省香蕉全果和土壤中丙环唑的半衰期分别为13.9 和23.3 d，残留量最高为0.367 mg/kg，本研究结果与该结果相近。本研究为保证丙环唑科学合理施用，评价丙环唑在香蕉上的安全使用提供了重要参考依据。