寄生桑树的粗毛纤孔菌优良菌株筛选研究

宋永学 李季生 高妍夏 贾漫丽 李 娜 杨贵明

(河北省高校特产蚕桑应用技术研发中心，承德医学院蚕业研究所，河北承德 067000)

粗毛纤孔菌(Inonotushispidus)是桑黄的一种，主要寄生于桑树等树种的活立木上，属于担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes)，绣革孔菌目(Hymenochaetales)，绣革孔菌科(Hymenochaetaceae)，纤孔菌属(Inonotus)[1]，药用价值很高，民间被用于治疗各种疑难疾病，如各种癌症、糖尿病、痛风、关节炎、咳嗽、消化不良[1-2]等。现代医学研究表明，粗毛纤孔菌的子实体含有丰富的多糖、多酚、三萜类物质和其它活性物质[3-7]，抗肿瘤效果明显[8]，甚至超过火木层孔菌 (Phellinusigniarius)和木蹄层孔菌(Fomesfomentarius) 两种桑黄[9]。另外，有研究表明粗毛纤孔菌在增强免疫力、抗氧化、抑菌、抗病毒和降血糖等方面也有显著功效[10-12]。

目前，关于粗毛纤孔菌人工栽培的报道很少[13-14]。我们从2013年开始研究粗毛纤孔菌的人工培养，但存在出菇率和产量低的问题，而且大部分子实体分化不完全，不能分化出如野生子实体的菌盖和菌孔，以致品质较差。研究中发现，用不同粗毛纤孔菌子实体的孢子分离培养的菌株，进行人工培养时在出菇率、子实体形状、产量等方面存在较大差异，部分菌株在产量和品质方面明显优于其它菌株。因此在研究栽培技术的同时，筛选优良菌株具有十分重要的意义。本研究通过对大量菌株栽培试验，进行相关性状比较，以筛选出适合人工栽培的优良菌株。

1 材料和方法

1.1 菌种来源

来源包括：采摘自承德医学院蚕业研究所桑园和承德避暑山庄老桑树上的粗毛纤孔菌子实体，通过组织分离法或孢子分离法得到的1代菌株，从1代菌株培养的子实体用孢子分离法得到2代菌株，总数有30多个，但大部分在母种培养阶由于菌丝长势太弱而在第1轮筛选中淘汰，用作出菇试验的菌株只有10个，编号分别为：826-3、826-4、919-1、1013-1、1013-2、1013-3、1013-6、1031-1、1031-2、1018-3；另有引自吉林农业大学的原寄生于蒙古黄榆上的粗毛纤孔菌(编号JLHY)。

1.2 培养基

母种培养基为PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL)。

原种培养基为谷粒培养基(谷粒98%，碳酸钙1%，石膏1%；含水量约60%)。

栽培种培养基：一年生桑枝粉60%，棉籽壳30%，麦麸8%，蔗糖1%，石膏1%；含水量60%。

1.3 试验方法

组织分离法、母种培养和原种培养方法见文献[15]。

1.3.1 多孢子分离培养

选取生长成熟、个大健壮、刚开始弹射孢子的粗毛纤孔菌子实体，在超净工作台上悬挂于玻璃钟罩内，钟罩倒扣在消毒过的培养皿上方， 1～2天后即可完成孢子弹射分离。将弹射出的孢子粉用无菌水稀释，接种于装有PDA培养基平板的培养瓶中，每个子实体产生的孢子粉接3～5个培养瓶。菌丝长出后，选取萌发快、长势好、无污染的菌丝块接入PDA试管培养基内培养，每个培养瓶接3～5个试管，根据生长发育情况选出菌丝生长最快的试管作为备选菌株。

1.3.2 栽培种培养

栽培种菌袋选用聚丙烯栽培袋(17 cm × 35 cm)，每袋干料约450 g，含水量约10%，折算干物质405 g。装料后在中间插入长20 cm的打孔棒，消毒后在打孔处分上中下三处接入原种，每个菌株接种10袋，然后置于培养室内黑暗培养，保持温度26～28 ℃，相对湿度60%～70%。记录菌丝长满菌袋时间。

1.3.3 出菇管理

待菌丝长满菌袋后再培养10 d使菌丝吃料完全，然后转入出子实体培养室，袋口向上摆放，25～28 ℃见光培养，空气相对湿度60%～70%。10天后开口，即在菌袋的肩部或出现子实体原基处用刀划一个(4～5) cm×1 cm的横向小口，此后控制空气相对湿度在85%～93%，并保持适当通风，光照为自然散射光，光强度<1000 lx。

1.3.3 调查项目

包括自接种至菌丝长满菌袋的时间、出菇率(即菌袋长出子实体的比例)、野生形子实体(有明显菌盖和菌孔)比例、单袋产量(即每个菌袋子实体产量，以干重计)、生物学转化率及其它外观表现性状。

粗毛纤孔菌子实体的生物转化率=单袋产子实体总干质量/单袋培养料干质量×100%

1.3.4 ITS基因测序分析

将试验中性状表现差异较大的4个菌株(826-4、1012-6、1018-3、1031-2)的子实体和2个野生粗毛纤孔菌子实体【包括从承德避暑山庄采集的(编号2015SZ)和承德医学院蚕业研究所老桑园内采集的(编号2015T)】进行ITS基因测序分析。

测序方法：取桑黄子实体菌盖组织，放入组织研磨破碎仪破碎。按照文献[16]中CTAB法提取桑黄的DNA。

引物序列ITS：5F(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)，4R(TCCTCCGCTTATTGATATGCPCR)。扩增体系：2xPCR Mix 12.5 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA 1 μL， ddH2O 11.1 μL。

PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min， 72 ℃延伸1.5 min，35个循环(每个循环延伸时间逐渐增加3 s)，最终72 ℃延伸7 min。4 ℃保存。PCR产物送中国农业科学院作物科学研究所进行测序。

另外从NCBI(美国国立生物技术信息中心)下载三份粗毛纤孔菌基因序列(登记号分别为EU918123.1、KX881611.1、FR686562.1)，使用DNAMAN6.0软件与测序结果进行序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 菌丝生长速度比较

从表1可见，由于采用上中下三段式接种，菌丝从不同部位由内而外长出，除JLHY满袋时间为28 d，显著长于其它菌株外，其余菌株满袋时间均为18～20 d，菌株之间无显著差异。

表1 不同菌株菌丝及子实体生长情况比较

注：表中小写字母表示在0.05水平上差异显著，大写字母表示在0.01水平上差异显著。

2.2 出菇率及野生形子实体比例比较

从表1可见，不同菌株出菇率方面差别较大，826-4、826-3、1018-3、1031-2出菇率均为100%，其中826-4和1018-3出菇最快，出菇整齐，子实体均为野生形状，826-3出菇整齐度稍差，子实体90%为野生形状；JLHY多次开口均未有子实体生长；其它菌株出菇率从80%到50%不等，有许多是在第2次或第3次开口后才长出子实体，野生形子实体的比例差异也较大，从25%到75%不等。

2.3 子实体产量比较

从表1可见，不同菌株子实体产量差异较大，其中以826-4产量最高，平均每袋产子实体干质量为33.40 g，生物学转化率达到8.25%，826-3和1018-3次之。因同一菌株内菌袋间产量相差较大，且有不少菌袋未长出子实体，导致一些菌株间差异显著性并不明显。

2.4 外观表现

在母种培养和原种培养两个阶段的后期，1018-3的菌丝颜色比其它菌株都明显要浅很多，为鲜嫩的白色至浅黄色，而其它菌株则为黄色至棕黄色。

在开口前的见光培养期间，826-4和826-3大部分会形成明显的略向外凸起的子实体原基，而在此处开口则会很快形成野生形的子实体，此特征以826-4更为明显，而其它菌株在此期间基本不会形成明显的子实体原基。

在出菇培养阶段，1018-3出菇速度最早，出菇培养第2天就形成明显的菌蕾。另外，部分1018-3子实体发育时，会形成没有明显菌盖、表面全是菌孔的猴头状子实体，其它菌株均无此现象。

2.5 ITS基因测序分析结果

6个粗毛纤孔菌菌株的ITS基因序列和下载到的三份其它粗毛纤孔菌的ITS基因序列的对比图见图1，粗毛纤孔菌ITS基因序列同源树的构建见图2。

由图1和图2可以看出，6个菌株间几乎没有差异，与其它三份ITS基因序列差异也很小，说明它们同属于粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus)，并且相互之间亲缘关系很近。

3 讨 论

试验结果表明，粗毛纤孔菌不同菌株间存在显著差异，但此差异并没有体现在ITS基因序列上。

野生形子实体比例体现该菌株的子实体的总体品质，从结果看，其高低与该菌株的平均产量是相关的，因此野生形子实体比例应做为筛选优良菌株的重要性状。

菌袋开口之前形成子实体原基，对于确定适宜的开口时间和开口位置十分重要，是一个可指导生产的好性状。

粗毛纤孔菌母种和原种期间的菌丝颜色在一定程度上可体现菌丝的活力，颜色越浅活力越强，1018-3在母种和原种培养后期颜色明显较其它菌株浅，而在出菇培养时出菇最早，若此二性状关联，则可在菌株筛选时，通过比较母种和原种期间菌丝颜色进行初选。

图1 ITS基因序列对比图

图2 ITS基因序列同源树

本次试验中，引自吉林的原寄生于蒙古黄榆的粗毛纤孔菌菌株未能生长子实体，因未进行重复试验，还不能确定是否为菌种的原因。

综上所述，粗毛纤孔菌优良菌株的筛选，对提高人工栽培中的产量和品质具有重要意义。试验中筛选出的826-4和1018-3，在产量和品质方面表现较好，优势突出，且在后续的栽培试验中也表现稳定，可以作为优良菌株进行中试试验。