不同海拔对晾制后雪茄烟致香前体物质含量的影响

刘 慧 刘博远 金明珂 阳苇丽 张思唯 赵铭钦

（1河南农业大学烟草学院，450003，河南郑州；2四川省烟草公司达州市公司，635000，四川达州）

相关研究[1-2]表明，海拔高度的变化能够引起太阳辐射量、有效积温、昼夜温差以及空气湿度等条件的改变，是影响烟叶产质量的重要生态因素之一，其对烟叶生长发育的影响程度明显高于土壤类型和土壤理化性状等生态因子。

烟叶中香气物质的种类繁多，并且大多数的含量极低，烟叶的香气物质包括致香物质和致香前体物质[3]。根据形成香气物质的途径，将烟叶中能产生香气的前体物划分为色素、多酚、有机酸和生物碱等[4]。这些致香前体物质会在烟叶的生长、成熟、调制及陈化过程中转化和降解成能够直接影响烤烟风味的香气物质[5]。其中多酚和有机酸在烟叶燃烧过程中能够中和酸碱度，改善吃味，使烟吸味醇和，增加烟气浓度，间接影响烤烟的抽吸品质和香气味，同时为烟叶的品质及可用性提供参考依据[6-9]。烟叶中的色素主要包括叶绿素（叶绿素a和叶绿素b）和类胡萝卜素（紫黄质、新黄质、β-胡萝卜素和叶黄素）[10]，其在吸味、烟气安全性、颜色和香气等方面影响烟草的品质，在调制和陈化过程中，叶绿素会降解成具有青果香味的新植二烯和陈化烟香的吡咯类化合物，而类胡萝卜素会降解为酮类等重要的致香成分[11]。生物碱是由烟株根系在数种酶的催化下合成后输送至烟叶内储存的，主要影响烟气的浓度和劲头。刘鹏飞等[12]研究表明，绿原酸和莨菪亭含量占多酚类物质总量的比例与海拔高度呈负相关和极显著负相关，而芸香苷含量随着海拔的升高而升高，并且表现为极显著正相关，高海拔有利于提高多酚类物质含量[13]。王淼等[14]和杨志晓等[15]研究发现，高海拔条件下具有较高含量的叶黄素，且叶绿素a/叶绿素b和叶绿素/叶黄素比值也较大，但色素含量因品种及部位不同而异[13]。随纬度降低和海拔升高，年有效积温、年日均温、种植期均温和无霜期对类胡萝卜素降解产物均有促进作用[16-17]。但生物碱变化趋势与多酚色素多有不同，研究[18-20]表明，海拔升高导致的昼夜温差及太阳辐射量的改变导致烟碱含量随海拔的升高呈极显著下降的趋势，但随着海拔的升高，其降幅减缓。简永兴等[1]通过对不同海拔对烤烟生物碱组成的研究得出，适当提高种植海拔，有利于提高烤烟烟碱所占百分率，降低微量生物碱所占百分率，从而降低烟气的刺激性，提高烤烟品质。王树会等[21]研究发现，烟叶中总有机酸含量在1400～1600m海拔时较高，而在1200～1400m海拔时最低。也有研究[22-23]指出，1800m海拔条件下高级脂肪酸含量较高，1500m海拔下有机酸总量最高，1300m海拔时有机酸含量适中，1050～1300m海拔下非挥发性有机酸总量高于950～1150m海拔。

目前，有关雪茄烟的栽培生理和晾制条件等研究较多，但关于海拔对雪茄烟致香前体物质的影响鲜见报道。本研究分析四川省达州万源地区雪茄烟中致香前体物质含量与海拔的关系，以期为特色优质雪茄烟叶开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在四川省达州市万源县河口镇进行，3个不同海拔梯度烟田分别是1301（高）、941（中）和798m（低）。该地区生育期内日均温度20.80℃，平均温差10.18℃，≥10℃积温1852.94℃，日照时数443.73h，平均相对湿度70.84%，降雨量480.33mm。试验地土质均为紫色土。

1.2 试验材料

供试品种为川雪1号，于2019年4月30日进行移栽，行距120cm，株距40cm。在每个海拔分别设置6个采样区，上部叶和中部叶分别取1kg，共计36份样品。田间管理同常规雪茄烟生产，烟叶适熟采收，采用统一晾房进行晾制。

1.3 测定指标及方法

参照烟草行业标准，采用液相色谱法对样品中的类多酚成分含量[24]及质体色素类化合物含量[25]进行测定。

准确称取0.10g烟草粉末，置于15mL具塞试管中，配制己二酸内标溶液100μL，倒入具塞试管中与样品充分摇匀。再加入10%（体积分数）硫酸-甲醇溶液2mL，振荡5min，室温放置过夜，进行甲酯化反应，然后加去离子水和二氯甲烷各5mL，萃取3次，采用硫酸甲酯化-气相色谱测定烟叶中挥发性有机酸含量。

将样品于50℃烘干后粉碎，过250µm筛。每个样品称200mg烟末，置于15mL旋盖培养试管中，加入内标溶液（7.5µg/µL正十六烷内标溶液）100µL、10%NaOH溶液1.5mL和甲基叔丁基3.0mL，旋紧旋盖，充分振荡5min，室温放置（24±2）h后提取上层清液，通过Agilent7890A型气相色谱-氢火焰离子化检测器（美国Agilent Technologies公司）定量分析4种生物碱（烟碱、降烟碱、假木贼碱和新烟草碱）的含量。

1.4 数据处理

采用Excel 2019、SPSS 24.0及DPS 6.0软件处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 海拔对雪茄烟多酚含量的影响

如表1所示，随着海拔的升高，多酚含量整体呈升高趋势，且中部叶和上部叶变化趋势相近，以高海拔多酚含量最高，高于或显著高于中、低海拔，中、低海拔间没有显著差异；各指标间以云香苷含量最高，绿原酸和莨菪亭含量较低。高海拔上部叶和中部叶多酚总含量分别较低海拔增加61.17%和65.70%。

表1 海拔对雪茄烟多酚含量的影响Table 1 Effects of altitude on polyphenol content of cigar mg/g

2.2 海拔对雪茄烟色素含量的影响

由表2可知，随海拔的升高，晾制后雪茄烟叶中叶黄素与β-胡萝卜素含量呈上升趋势，高海拔上部叶叶黄素及β-胡萝卜素含量较低海拔增加12.05%和29.43%，中部叶与上部叶变化趋势相近，高海拔叶黄素及β-胡萝卜素含量较低海拔增加32.95%和21.46%。烟叶中叶绿素含量变化恰好与叶黄素和β-胡萝卜素含量相反，随着海拔的升高叶绿素含量显著下降（P＜0.05），其中高海拔上部叶叶绿素含量较低海拔下降92.35%，中部叶叶绿素含量下降45.12%。

表2 海拔对雪茄烟色素的影响Table 2 Effects of altitude on pigment of cigar μg/g

2.3 海拔对雪茄烟有机酸含量的影响

由表3可知，随海拔升高，草酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸及总有机酸含量均呈一致的变化趋势，且高海拔与中、低海拔间大部分差异显著。高海拔与中、低海拔相比，上部叶草酸含量分别增加了40.45%和46.09%，丙二酸含量分别增加了25.33%和30.85%，苹果酸含量分别增加了17.76%和24.41%，柠檬酸含量分别增加了13.54%和30.90%，有机酸总量分别增加了20.43%和29.80%。中部叶与上部叶的变化趋势相近，表明随着海拔升高，环境因素的改变，烟叶有机酸含量发生一定规律性变化。

表3 海拔对雪茄烟主要有机酸含量的影响Table 3 Effects of altitude on the contents of main organic acids in cigar mg/g

2.4 海拔对雪茄烟生物碱含量的影响

如表4所示，上、中部烟叶晾制后烟叶的总生物碱含量整体上随种植海拔的上升而显著下降（P＜0.05），上部叶和中部叶高、中、低海拔生物碱总含量分别为8.75%、7.00%及4.12%，随叶位由下而上逐步增加。5种生物碱在不同海拔间大部分存在显著差异，其中中、低海拔烟碱、降烟碱、麦思明和生物碱总含量显著高于高海拔，假木贼碱和新烟草碱含量在大部分海拔间差异不显著。在5种生物碱中，烟碱含量最高，降烟碱次之，麦思明最低。

表4 海拔对雪茄烟生物碱含量的影响Table 4 Effects of altitude on alkaloid content in cigar %

2.5 海拔与致香前体物质灰色关联度分析

以海拔为参考数列，各致香物质含量为比较数列，计算关联度（表5）。由表5可知，上部叶各致香前体物质指标与海拔的关联度顺序为多酚＞生物碱＞色素＞有机酸；中部叶各致香前体物质指标与海拔的关联度顺序为多酚＞色素＞有机酸＞生物碱。总体来说，海拔对多酚影响最大（关联度排序第1位）；就上部叶来看，海拔对生物碱影响也较大；海拔对中部叶各指标的影响程度中多酚影响程度最大，色素次之，生物碱最小。

表5 海拔与致香前体物质关联度及排序Table 5 Correlation between altitude and aroma precursors

3 讨论

烟草酚类物质包括酚及其衍生物，在烟草生长和调制过程中有着重要的作用[26]，是评价烟叶品质的重要指标。当烟株处于不良环境时，烟株体内调控酚类物质生物合成的酶活性升高，酚类物质的积累增加抵抗不利环境因素[27]，如本研究中随着海拔的升高，光照强度及紫外线明显增强，为了免受强紫外线辐射伤害，植物启动逆境反馈机制，加速诱导酚类物质合成，吸收紫外线和消除因呼吸作用和光合作用产生的自由基[28]，引起多酚含量增加。朱小茜等[29]研究发现，损失紫外光区的光线会导致烟叶多酚含量及多酚氧化酶活性降低。相应地，海拔越高，多酚类化学物含量就越高，与本研究结果一致。

质体色素（叶绿素、类胡萝卜素及其降解产物）对烟叶的质量有重要影响[30]。本研究结果表明，高海拔区域叶绿素含量较低，但类胡萝卜素（叶黄素和β-胡萝卜素）含量呈升高的趋势。由此看出，随着海拔的升高，植物叶片中的叶绿素含量呈降低的变化趋势[15]，由于叶绿素含量下降，能够减少叶片对光能的大量吸收，从而使植物免受强光照辐射的损伤。在其他植物中也发现类似规律[31-33]。类胡萝卜素在植物体内具有重要保护功能[16]，具体原理为，一方面，类胡萝卜素分子中的共轭双键可以强烈吸收紫外光谱区域的辐射，通过增加叶片表皮层中紫外吸收物质含量来影响紫外线辐射的穿透性，减少进入叶肉组织的紫外线辐射量，避免叶绿素的光氧化；另一方面，通过直接吸收紫外线辐射，从而减少紫外线对植物的伤害，尤其是对光合系统Ⅰ和Ⅱ的破坏[34-35]。且高海拔地区光照强烈、昼夜温差大可促进类胡萝卜素积累[36]，此结论与王京等[37]和韩锦峰等[38]的研究结果一致。但超过一定海拔，质体色素及其降解产物含量会随海拔升高而降低[39]。

有机酸类物质是植物生长发育过程中含氮化合物和碳水化合物代谢过程中重要的中间产物，也是呼吸作用中三羧酸循环的中间产物。本研究结果表明，高海拔烟叶有机酸含量显著高于中、低海拔，由于上部叶位置较高，光照充足，利于光合作用积累，有机酸含量整体上表现为上部叶＞中部叶，高海拔＞中海拔＞低海拔，此结论与前人[40-41]研究结果相一致。但简永兴等[42]研究发现，烤烟云烟87的草酸及柠檬酸含量均随海拔的上升而下降，王育军等[43]认为，大田期5月、8月和9月平均昼夜温差增加，会显著或极显著引起烟叶苹果酸、柠檬酸和有机酸总量的降低，此结论与本研究结果略有不同，可能是海拔超过一定高度后有机酸变化规律会发生改变，或因雪茄烟与烤烟类型间差异造成。

生物碱由烟株根系在数种酶的催化下合成后输送至烟叶内储存[44-45]。本研究结果显示，烟叶的烟碱含量随种植海拔升高而下降，与简永兴等[42]研究结果相似。海拔升高改变了太阳辐射量、有效积温、昼夜温差和空气湿度等生态因子，这些改变可促使根系烟碱合成酶活性下降，使烟株对土壤氮素的吸收能力下降，从而降低烟碱的合成速度[42]。且另一方面随海拔升高，土壤温度下降，使得烟株根系催化生物碱合成酶的活性下降，从而使得生物碱合成速度减慢[45-46]。同时，海拔升高导致的昼夜温差及太阳辐量的改变也可能对生物碱合成起到了一定的阻碍作用[47]，最终导致生物碱总含量随种植海拔的上升而下降。

综上所述，适当提高雪茄烟种植海拔，可以降低叶绿素含量，减轻烟叶燃吸时产生的青杂气[30]；提高类胡萝卜素和非挥发性有机酸含量，类胡萝卜素可降解成为香味阈值虽低但香气质较好的香味物质，非挥发性有机酸可在烟叶燃烧过程中中和酸碱度，改进吃味，使烟吸味醇和；增加生物碱，可提高烟气浓度，间接影响烟叶的抽吸品质和香气味[6-9]。因此，适当提高种植海拔可在一定程度上改善烟叶品质。

4 结论

海拔对致香前体物质具有一定的影响。叶绿素与生物碱随海拔升高呈下降的趋势，多酚、类胡萝卜素及有机酸含量随着海拔升高而逐渐升高。由灰色关联度分析结果看出，海拔与致香前体物质各指标关联度不同，且不同部位影响程度也不尽相同，整体来看，对多酚含量影响较大，对有机酸含量影响较小。综合分析，适当提高种植海拔可以使雪茄烟抽吸时香味物质更浓郁。