烤烟生长期叶片颜色特征值及其氮素诊断模型

朱莹雪， 王琪， 马献发*， 焦玉生， 高金旭， 毛卫佳，付佳， 孙雪岽， 元野

（1.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030； 2.中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所，哈尔滨 150076； 3.黑龙江省烟草公司牡丹江烟叶公司，黑龙江 牡丹江 157011； 4.中国烟草总公司黑龙江省公司，哈尔滨 150001； 5.牡丹江烟叶公司勃利分公司，黑龙江 七台河 154500）

氮素是烤烟生长过程中的必需营养元素之一，施氮量过多或过少都会对烟叶的品质和产量产生不利影响，适宜的施氮水平和施肥时期是保证烟叶品质及产量的关键。因此，如何快速简便地进行氮素营养诊断是指导烤烟田间管理的当务之急。烤烟氮素营养诊断的方法主要包括常规化学分析法、叶绿素仪法和高光谱技术。常规化学分析法需在实验室进行，且其前处理和分析过程均较为繁琐，时效性差。叶绿素可通过叶绿素仪对叶片SPAD 值的检测间接反映烟叶全氮含量，虽然方便在田间使用且无需采集烟叶，但叶绿素仪价格昂贵，且农户无法得知确切的全氮含量。高光谱技术能反映植物的物理结构和化学成分等内在品质[1]，无需采集烟叶就可估测烟叶全氮含量，但需要专业仪器，成本较高且操作繁琐[2]。颜色特征值法是氮素营养诊断的新方法，该法利用红色（red，R）、绿色（green，G）、蓝色（blue，B）、亮度（lightness，L）特征值构建叶片氮素含量诊断模型，并将模型应用于智慧农业，可实现快速简便的氮素营养诊断。颜色特征值主要由构成各种色彩的3 个原色R、G、B 组成,可通过数码相机及智能手机等便携电子设备记录待测叶片颜色特征，并将颜色的深浅转换为数字[3]，从而快速准确地读取图像中包含的颜色信息[4]。植物叶片颜色由叶片细胞内色素（叶绿素、胡萝卜素等）的相对含量决定，因而，前人研究了烤烟叶片颜色特征与质体色素的关系及其估算模型。徐光辉等[5]利用颜色特征值和叶绿素含量构建烟叶成熟期叶绿素含量估算模型，模型的估算值与实测值呈现极显著正相关。靳双珍等[6]发现，颜色特征值与烤烟质体色素含量和多酚类物质含量之间存在相关关系，如颜色特征值正面L 与烤烟β 胡萝卜素含量呈负相关，与叶黄素含量呈正相关；背面黄度（yellow，Y）与烤烟芸香苷含量呈负相关[7]，因此，在实际生产中可利用颜色特征值对烤烟质体色素和多酚类物质含量的高低进行判断。研究发现，将R、G、B颜色坐标转换成孟塞尔颜色系统后，可用于烤烟的自动分级[8]，以减少人为因素的误差。Zhi 等[9]构建彩色图表系统（color chart system，CCS），通过配备电荷耦合器件图像传感器（charge coupled device，CCD）精确提取烟叶颜色，利用比例阈值法构建HSV（hue，色调；saturation，饱和度；value，明度）颜色值与RGB 颜色值的转换公式来提高烟叶颜色图的准确性，使评价者对不同地区烟叶的颜色鉴别能力提高了30%以上。利用颜色特征值分析植物叶片含氮量及叶绿素含量的研究已在大豆、番茄、苎麻等作物上广泛应用[10-12]。除此之外，通过RGB 图像构建模型还可用于测量叶片含水量[13]、估算微藻生物量[14]、预测作物产量[15]，由此表明，利用RGB 颜色系统构建相关模型是切实可行的。以叶片颜色特征值R、G、B、L与氮素含量的关系模型检测烤烟的氮素盈缺状况可以为未来智慧农业提供技术支持。目前，关于烤烟叶片颜色特征值主要集中在叶片叶绿素、品质分级方面，而利用叶片颜色特征值对烤烟叶片进行氮素诊断的深入研究尚未见报道。因此，本文通过研究烟叶颜色特征值、全氮含量及烟叶SPAD 值对氮肥响应变化特征，明确与烟叶全氮含量显著相关的颜色特征参数，建立RGB 颜色特征值与烟叶全氮含量之间的诊断模型，为烤烟生长期的氮素营养诊断及未来智慧农业发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验地在中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所试验场（44.382 7° N，129.472 8° E），海拔277.34 m，属中温带湿润季风气候区，土壤类型为黑土，土壤基础肥力如表1所示。

表1 土壤基础肥力Table 1 Soil basic fertility

1.2 试验设计

烤烟品种为‘龙烟911’，采用苗棚育苗，于7叶龄移栽到大田。供试氮肥为硝酸铵（N，34%），磷肥为重过磷酸钙（P2O5，46%），钾肥为硫酸钾（K2O，50%）。试验共设置7 个施氮量处理，每处理3 次重复。其中部分氮肥于移栽前作为基肥施入，剩余氮肥于移栽后作为追肥施入，如表2 所示。各处理磷钾肥施用量一致，其中重过磷酸钙150 kg·hm−2，硫酸钾270 kg·hm−2，均作为基肥于移栽前施入。株距0.5 m，行距1.1 m，垄长6.0 m，小区面积39.6 m2（6垄）。

表2 各处理施肥量Table 2 Rate of fertilization of different treatments

1.3 样品的采集及测定

1.3.1样品的采集 在烤烟团棵期（移栽后35 d）及旺长期（移栽后55 d），每个小区随机选取5 株烤烟，分别采集上部叶片（从根部开始第8~9 片叶）、中部叶片（从根部开始第5~7片叶）和下部叶片（从根部开始第3~4 片叶）。烟叶扫描图像后，用于全氮含量的测定。

1.3.2烤烟叶片全氮含量的测定 将采集的烟叶置于烘箱中105 ℃杀青30 min，65 ℃烘干至恒重，粉碎、过0.25 mm筛后密封保存,采用H2SO4-H2O2消煮的奈氏比色法[16]测定烟叶全氮（total nitrogen，TN）含量。

1.3.3烤烟叶片SPAD 值的测定 在烤烟团棵期及旺长期，随机在每小区选取代表平均长势的10 株烤烟，分别选取下部叶、中部叶及上部叶，利用便携式叶绿素仪SPAD-502测定每片叶片顶部、中部、基部的SPAD值，取平均值。

1.3.4烟叶图片的获取与颜色特征值的提取 烟叶图像利用扫描仪（Cano Scan 9000F）数字化成像，逐个扫描叶片正面颜色，图像分辨率大小为2 550×3 504 像素，存储格式为JPG 格式。采用Adobe Photoshop 7.0 图形软件进行图像分析并提取颜色特征值。通过工具面板的魔术棒工具选择所需要的叶片部分，然后再选择“窗口”中的直方图程序读取R、G、B 和L的图像均值[17]。若烟叶幅面大于扫描仪最大幅面时，分幅扫描、存储，取其相应特征值的平均值。

1.3.5数据的选取 将测定的颜色特征值和烟叶全氮含量分为2 组，其中1 组样本（n=42）用于分析建模；另1组样本（n=21）用于检验。

1.4 建模方法

烟叶全氮含量与颜色特征值建模采用多元逐步回归分析，方程如下。

式中,X1，X2，…XP代表颜色特征参数，ε为参数。若有n组样本，则公式（1）会形成矩阵，如式（2）所示。n组样本分别是（Xi1,Xi2, ...XiP,yi), (i=1, 2, ...,n)，形成矩阵如下。

根据式（2）得出多元线性逐步回归方程。

式中，β代表斜率。

1.5 数据处理

采用Excel 2007 软件进行数据分析，采用SPSS 22.0 软件进行方差分析，利用Duncans 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同施氮量对烤烟叶片全氮含量的影响

由图1 可知，团棵期各部位叶片的全氮含量均高于旺长期，且团棵期和旺长期叶片全氮含量均表现出上部叶片>中部叶片>下部叶片。其中，在团棵期，仅上部和中部叶片的全氮含量在处理间存在显著差异；在旺长期，各部位叶片在不同处理间均存在显著差异。由此表明，不同施氮量处理对旺长期的叶片全氮含量影响较大。

图1 不同处理下各部位叶片在团棵期和旺长期的全氮含量Fig. 1 Total nitrogen content of leaf under different treatments in rosette and fast growing periods

2.2 不同施氮量对烤烟叶片颜色特征值的影响

由图2 可知，颜色特征值B 的上下边缘相距较近，数据最大值与最小值间的差值较小，说明数据较为集中，离散程度小，对不同施氮量变化不敏感；而颜色特征值R、G、L 的上下边缘相距较远，数据最大值与最小值间的差值较大，离散程度较大，且颜色特征值的中位数均靠近上部，说明颜色特征值R、G、L 对氮素含量的变化较为敏感，其中颜色特征值G的数值最大。

图2 颜色特征值箱形图Fig. 2 Box-plot of color characteristic value

2.3 烟叶全氮含量、SPAD 值及颜色特征值之间的关系

2.3.1烟叶全氮含量与SPAD 值关系 SPAD 值可以反映叶片的叶绿素含量。分析烤烟叶片全氮含量与叶片SPAD 值之间的关系（图3）表明，烤烟叶片SPAD 值随叶片全氮含量的增加而增加，二者呈极显著正相关(P<0.01)。由此说明，叶片SPAD 值的大小可以间接反映叶片的全氮含量，即烤烟叶片叶绿素含量越高，其叶片全氮含量也越多。

图3 叶片全氮含量与叶片SPAD值的关系Fig. 3 Correlation between the total nitrogen content and SPAD value of tobacco leaves

2.3.2烟叶SPAD 值与颜色特征值关系 由图4可知，叶片SPAD 值与颜色特征值之间存在显著或极显著的负相关关系，其中与颜色特征值R、G、L 均呈极显著负相关(P<0.01)，与颜色特征值B 呈显著负相关(P<0.05)。相关系数（r）表现为rR>rL>rG>rB，说明颜色特征值R与叶片SPAD值之间的相关性最高。

图4 烟叶SPAD值与颜色特征值相关性Fig. 4 Correlation between SPAD value and color characteristic value of tobacco leaves

2.3.3烟叶全氮含量与颜色特征值关系 对烤烟叶片全氮（total nitrogen,TN）含量和颜色特征值进行相关分析，结果（表3）表明，烟叶全氮含量与颜色特征值L、R、G 及L/(R+G)、B/R、B/G、L/B、R+B、B+G、R+B+G+L均呈极显著相关，与颜色特征值R/(G+B)、R+B/(R+B+G)呈显著相关，与颜色特征值B和G/R相关不显著。

表3 烟叶全氮含量与颜色特征值相关性Table 3 Correlation between total nitrogen content and color characteristic value of tobacco leaves

2.4 烟叶氮素诊断模型的建立与检验

2.4.1模型的建立 由于烟叶全氮含量与颜色特征值之间存在较好的相关关系，因此利用SPSS 22.0软件对旺长期烟叶的全氮含量与颜色特征值进行多元逐步回归分析。以颜色特征值为自变量，以叶片全氮含量作为因变量Y，将数据带入1.4中的建模理论，得出以下方程。

经分析该模型未达到显著水平（P>0.05），因此剔除不显著项，得到以下模型。

分析发现该模型达到显著水平（P<0.05），说明剔除不显著项后的模型预测效果更好。

2.4.2模型的检验 首先将旺长期测得的颜色特征值数据代入公式（5），计算叶片全氮含量；然后将模型计算出的预测值与旺长期叶片全氮含量的实测值进行相关性分析，结果（图5）表明，模型计算出的烟叶全氮含量预测值与烟叶全氮含量实测值呈极显著正相关(P<0.01)，说明模型的预测效果较好。

图5 烟叶全氮含量预测值与实测值的相关分析Fig. 5 Correlation analysis between simulated and actual values of total nitrogen content in tobacco leaves

3 讨论

本研究表明，不同施氮量处理下烤烟叶片的全氮含量在旺长期差异更为显著，这可能是由于团棵期烟株需氮量较少，因此各处理间叶片氮素含量变化差异较小；而旺长期是烤烟吸收氮素的高峰期[18]，低氮量处理氮肥供应不足，叶片全氮含量开始有所降低，导致各处理间差异显著。团棵期和旺长期各部位叶片的全氮含量均呈现出下部叶片<中部叶片<上部叶片的趋势，这可能是因为上部叶多为刚长出的新叶，其生长速度较快，且生长所需的营养物质主要依靠老叶的输送[19‑20]，因此烤烟下部叶对氮素含量的变化更为敏感。

叶片颜色特征值RGB 对叶片氮素含量的响应表现不同，其中颜色特征值G、R 对氮素含量变化较颜色特征值B更为敏感。这一规律不受叶片图像采集与颜色特征值提取方法影响，这在不同烤烟品种间[21]及其他作物[12]也具有相同趋势。因此，烤烟叶片颜色特征值RGB 预测叶片全氮含量具有广适性。

叶片颜色特征值RGB 对叶片氮素含量响应变化主要由叶片细胞内色素决定。Li 等[22]发现，红光波段的反射率与作物氮指数密切相关，且可见光区域作物的光谱反射率主要由光合色素（主要是叶绿素a 和b）的光吸收特性决定。Evans[23]发现，叶片氮含量与光合作用间存在一定的因果关系，即氮素含量和叶绿素含量间存在很强的线性关系，说明叶片含氮量可通过影响叶片叶绿素含量间接影响颜色特征值。Sun 等[24]探讨了西兰花叶绿素降解机理，发现随着西兰花叶绿素的降解，R 值和B 值均出现明显变化。植物叶色变化是由叶片内的叶绿素、类胡萝卜素和花青素3 种色素含量变化决定的[25]，当叶绿素含量高于其他2 种色素时，叶片呈现绿色。研究发现，叶绿素在光合作用中主要吸收红光和蓝光，反射绿光，其中R/(R+G+B)可作为估算玉米叶绿素含量最主要的颜色特征参数[26]；水稻叶片的颜色特征值与SPAD值呈指数关系[27]。因此，叶片的叶绿素、SPAD 值与颜色特征值间存在一定的相关性。

对比高光谱成像技术复杂的算法和昂贵的机器、叶绿素仪只能逐点测量且需要多次重复测量保证准确性的弊端[28]，应用颜色特征值技术构建出的烤烟氮素含量诊断模型，可以快速检测烤烟叶片全氮含量以及叶绿素含量[29-31]。但由于烤烟叶片诊断时期、叶位及采集图像设备的差异，基于叶片颜色特征参数构建的氮素诊断模型会略有不同。本研究基于扫描成像技术，在一定程度上保证了一致的光照、成像距离，且不受采集光照、时间和天气等因素影响，构建了烟叶全氮含量与颜色特征值的模型Y=1.465G+84.377(B/G)-1.004(B+G)−36.959，经检验，模型预测值与实测值呈极显著相关（P<0.01），故此模型可以应用于烤烟叶片的氮素诊断。由于不同烤烟种植区品种和水热条件可能存在差异，为了准确预测田间烤烟叶片的氮素水平，建议在田间应用颜色特征值氮素诊断模型时做进一步研究。