微生物絮凝剂的制备及对生活污水中COD的去除研究

陈金发，张 云，向地玖，殷敏超，余 玲

(1.西昌学院资源与环境学院，四川 西昌 615013； 2.西昌学院土木与水利工程学院，四川 西昌 615013)

0 引 言

微生物絮凝剂是微生物或其分泌物产生的代谢产物，这些代谢产物能将某些废水中的悬浮颗粒、胶体粒子和有机物等絮凝沉降[1]。微生物絮凝剂不仅具有絮凝沉降废水的作用，同时具有自身降解的能力，是一类无毒、安全、环保、不造成二次污染的絮凝剂[2]。目前关于微生物絮凝剂筛选和去除效果的研究方兴未艾，它是环保生物新材料的重要研究方向。在用微生物絮凝剂处理污水方面，国内外专家也进行了相关研究，如Junyuan Guo等采用筛选于活性污泥的微生物絮凝剂处理畜禽废水，在最优条件处理时，COD的处理效率为87.9%[3]。胡筱敏等筛选得到一株Bacillus mucilgnonsn.var，该菌株在处理淀粉生产中的黄浆废水效果优于目前广泛使用的PAC和PAM[4]。Ahmad H.RaJab Aljuboori等研究了一种新型微生物絮凝剂PM-5，并应用于处理河水的浊度，去除率达到63%[5]。微生物絮凝剂在生产过程中特别容易受到有毒物质的影响，因此，在制备过程中，一定要保证产絮微生物不被污染，培养环境无毒无害。目前，对微生物絮凝剂的研究程度还不够深入，而且应用领域大都局限在浊度的去除上。

本实验通过对比DEHP筛选法、吡啶筛选法、传统筛选法三种筛选方法，筛选出稳定、高效的微生物絮凝剂产生菌并研究了该菌株处理生活污水中COD的影响因素。实验可为微生物絮凝剂在生活污水处理中的进一步应用提供较好的数据参考。

1 材料与方法

1.1 微生物絮凝剂菌的筛选

1.1.1 样品的采集

本实验筛选微生物絮凝剂的样品分别取自农村玉米地土壤、污水沟底泥及生活污水厂污泥。

1.1.2 实验方法

微生物絮凝剂产生菌的分离和筛选是非常重要且工作量较大的环节。实验通过对比传统筛选法、吡啶筛选法和DEHP筛选法三种筛选方法的优劣，并从中筛选出絮凝效果高的微生物絮凝剂产生菌。

(1)传统筛选法。将各种环境样品接种到需要的富集培养基中，通过富集培养，稀释涂布等方法，挑选出生长较好、表面光滑带黏性的单体菌落，再通过测定高岭土悬浮液的絮凝效果对挑选出的菌种进行筛选，得出絮凝效果好的菌种[6]。

(2)吡啶筛选法。吡啶筛选法是将样品直接接入吡啶培养基，吡啶作为氮源，使得可以耐受吡啶的微生物生存下来，然后进行分离，得到单菌。通过絮凝测试，获得高效的絮凝剂产生菌。

(3)DEHP筛选法。日本学者仓根隆一郎(Ryuichiro Kurane)等通过研究最终分离筛选出一株能够分解利用苯二甲酸二异辛酯(DEHP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的菌种——红平红球菌(Rhodococcus enythropolis)，并进一步研制由红平球菌产生的能够沉降活性污泥的微生物絮凝剂，取名为NOC-1。降解DEHP和DBP可能与微生物絮凝剂的产生有一定的内在联系[7]。因此本研究采用DEHP作为唯一碳源的筛选方法进行絮凝剂产生菌的筛选与其他筛选方法进行比较。

1.2 微生物絮凝剂产生菌的16S rDNA鉴定

1.2.1 提取细菌基因组DNA

使用AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒(Axygen，康宁生命科学(吴江)有限公司)提取菌株DNA。

1.2.2 PCR扩增

(1)16Sr RNA/DNA PCR的通用扩增引物。Pimer1：27F(5’to 3’AGAGTTTGATC CTGG CTCAG)；Pimer2：1492R (5’to 3’GGTTACCTT G TTA GTTACGACTT)。

(2)50μL PCR反应体系。Mater Mix：25 μL；Primer 27F：1 μL；Primer 1492R：1 μL；Water：22 μL；模板DNA：1 μL。

(3)PCR扩增条件。94 ℃下预变性4 min，进入循环，94 ℃变性1 min，53 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，在72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃下进行保藏。检测出目标条带的PCR扩增产物送到成都飞腾博川(瑞信)生物公司进行测序。

1.3 微生物絮凝剂处理生活污水中的COD的影响因素

采集生活污水，初始COD浓度为300～500 mg/L。采用序批式实验研究微生物絮凝剂处理生活污水中COD不同因素如投加量、pH值、温度、振荡转速、氯化钙等的影响。取100 mL生活污水于250 mL烧杯中，调节到所需的pH值，在加入微生物絮凝剂后放入恒温培振荡培养箱中进行处理。COD采用重铬酸钾法测定。

2 结果与讨论

2.1 微生物絮凝剂产生菌的筛选与鉴定

对比3种筛选方法，筛选结果如表1所示。

表1 三种筛选方法的结果对比Tab.1 Comparision of the three sreening methods

利用传统筛选法，从样品中筛选出具有絮凝效果的菌种20株，具有高效絮凝效果的有6株；吡啶筛选法选出的菌种有11株，其中具有高效絮凝效果的菌种有2株，在高岭土悬浊液中发挥很好的絮凝效果，絮凝速度快，效果也好；DEHP筛选法选出的菌种只有3株，并且选出的菌种絮凝效果一般。综上所述，本研究最终采用传统筛选法。

对农村玉米地土壤、污水沟底泥及生活污水厂污泥三个样品采用传统筛选法进行筛选，最终污水沟底泥筛选出最高絮凝率的一个菌株，絮凝率达95%。对产絮凝剂菌株按上述方法进行分子生物学鉴定。利用Genbank处理测序结果，应用BLAST程序对Genbank数据库里的信息进行待测序列的同源性搜索，绘制出的系统进化树如图1所示。

图1表明产絮凝剂菌株与同类型的菌株路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)相似性最高84%。

2.2 各因素对微生物絮凝剂处理生活污水中COD的影响规律

2.2.1 pH值的影响

加入4 mL微生物絮凝剂于生活污水中，调节pH值分别到1～9，并分别进行振荡批次实验，振荡温度设定为30 ℃，先快速(200 r/min)振荡1 min，再慢速(60 r/min)振荡 3min。振荡完成后，静置3 min后取样测定COD。结果见图2。

如图2所示，pH值为2～7时，COD的去除率随着pH值的升高而增大。pH值为2～5时，COD的去除率由2.03%增加到14.22%。当pH值为5～7时，COD的去除率有大幅增加，且产生矾花。在pH值为7时，达到最高的COD去除率45.34%。pH>7时，COD去除率迅速降低。COD去除率的变化可能与pH值影响了营养物质的吸收和细胞酶促反应的效率有关[8]。

2.2.2 投加量的影响

调节生活污水pH值为7，分别加入0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、1、2、4、6 mL微生物絮凝剂，振荡温度设定为30 ℃，先快速(200 r/min)振荡1 min，再慢速(60 r/min)振荡 3 min。振荡完成后，静置3 min取样测定COD。结果见图3。

图1 基于16S rDNA序列的产絮凝剂菌株系统发育进化树Fig.1 Phylogenetic tree of the flocculant based on 16S rDNA

图2 pH值对COD的去除效果的影响Fig.2 Effect of pH on COD removal

图3 投加量值对COD的去除效果的影响Fig.3 Effect of bioflocculant dosage on COD removal

如图3所示，实验结果表明絮凝剂投加量在0.01～1 mL范围内，COD的去除率随着投加量的增多而增大。在投加量为1 mL时达到最佳去除效果，去除率达到41.7%。随着投加量的增多，COD的去除率随投加量的增大而降低。因此，絮凝剂投加量较多或者较少都对COD的去除率有抑制作用。当添加的絮凝剂过量时，它们之间强烈的排斥作用又会对COD的吸附起到抑制作用[9,10]。

2.2.3 振荡温度的影响

调节生活污水pH值为7，加入1 mL微生物絮凝剂，调节振荡温度为20、25、30、35、40 ℃，先快速(200 r/min)振荡1 min，再慢速(60 r/min)振荡3 min。振荡完成后，静置3 min取样测定COD。结果见图4。

图4 温度对COD去除效果的影响Fig.4 Effect of temperature on COD removal

如图4所示，在20～40 ℃之间，去除率有所上升，去除率在44%之间波动，最佳振荡温度为30 ℃，去除率达45% 。当超过40 ℃时，絮凝率迅速降低。这可能与如下原因有关。在一定的温度范围内，微生物机体的生长繁殖和代谢活动随着温度的上升而增加，但当温度上升或下降到一定程度，因机体的重要组成部分如蛋白质、核酸等都对温度敏感程度较强就会对有机体产生不利的影响，导致细胞功能急剧下降甚至死亡[11,12]。

2.2.4 氯化钙的影响

调节生活污水pH值为7，加入1 mL微生物絮凝剂，再分别加入0.1、0.2、0.8、1.4、2.0 mL浓度为2.5%的氯化钙溶液，放入振荡箱中，调节温度为30 ℃，先快速(200 r/min)振荡1 min，再慢速(60 r/min)振荡3 min。振荡完成后，静置3 min取样测定COD。结果见图5。

图5 氯化钙对COD去除效果的影响Fig.5 Effect of calcium chloride on COD removal

金属阳离子的助凝作用，是由于其能有效地降低被絮凝物的表面电荷，压缩双电层，从而加强复合菌产絮凝剂与胶粒间的吸附力，促进网状架桥的形成，使被絮凝物颗粒发生聚集沉降[13,14]。

如图5所示，实验结果表明氯化钙的投加量在0.1～0.8 mL范围内，COD的去除率随着投加量的升高而增大，在0.8 mL(5.33 mL/L)时，去除率最好，达到了72.2%，在0.8～2.0范围内，COD的去除率随氯化钙投加量升高而降低。尤其在投加量为2.0 mL时，COD去除率急剧下降。说明过量的Ca2+会严重抑制微生物絮凝剂的活泩[15]。

3 结 语

(1)通过传统筛选法、DEHP筛选法和吡啶筛选法优选微生物絮凝剂产生菌。传统筛选法较其他两种方法的筛出率更高。研究中利用传统筛选法从污水沟底泥中筛选出一株微生物絮凝剂产生菌，经过16S rDNA鉴定其属于路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)，该菌株对高玲土悬浮液去除率为95%。

(2)在最佳环境条件pH值为7.0，温度30 ℃，微生物絮凝剂投加量为1 mL，氯化钙投加量为0.8 mL时，先快速(200 r/min)振荡1 min，再慢速(60 r/min)振荡3 min后，COD去除率可达到最高的72.2%。

(3)通过实验研究表明，微生物絮凝剂不仅可应用于对悬浮固体的去除，同时也可应用于生活污水中COD的去除。因而对微生物絮凝剂的研究具有较强的工程应用价值。