玉米根系分泌物对连作花生土壤酚酸类物质化感作用的影响

李庆凯, 刘苹, 赵海军, 宋效宗, 林海涛,沈玉文, 李林, 万书波,*

(1.湖南农业大学农学院, 长沙 410128; 2.山东省农业科学院农业资源与环境研究所,山东省环保肥料工程技术研究中心, 济南 250100; 3.山东省农业科学院, 山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室, 济南 250100)

花生(ArachishypogaeaL.)是一种对连作较为敏感的作物，连作2～3 a，荚果可减产19.8%～33.4%[1]。研究表明，花生根际微生态系统综合功能失调是造成花生连作障碍的主要原因，主要表现为土壤微生物区系失衡、病原菌的累积、土壤理化性状的劣化以及花生根系分泌物的化感作用[2-4]。重茬种植条件下，花生根系分泌物在土壤中不断积累[5-6]。其中，酚酸类化合物是花生根系分泌物中存在的一种重要的次生代谢有机物，是主要的化感物质[6-7]，具有很强的生理和生态功能。一方面，酚酸类物质可对花生植株的生长产生自毒作用[2]，另一方面，酚酸类物质持续进入土壤可引起连作花生土壤微生物区系失衡、病原菌数量增加、土壤酶活性及土壤养分含量降低，造成花生产量降低[7-8]。酚酸类物质的化感作用在花生连作障碍的形成过程中起着重要作用。刘苹等[6]对不同连作年限花生收获后的土壤进行了酚酸类物质含量检测，发现连作3 a的土壤中肉桂酸、邻苯二甲酸和对羟基苯甲酸的总含量可达7.17 mg·kg-1干土，连作5 a达到9.90 mg·kg-1干土。田间条件下连作花生根系分泌物的产生是连续的，实时原位土壤中酚酸类物质浓度可能要远高于花生收获后的土壤。酚酸类物质在土壤中存在降解、部分被土壤颗粒吸附和微生物吸收等现象[9]。Haider等[10]通过14C标记研究了酚酸在土壤中的降解，发现1周内，90%的对羟基苯甲酸、紫丁香酸和香草酸被分解。因此，通过向土壤中添加外源酚酸类物质来研究其化感作用，有必要适当增加酚酸类物质的初始含量。近年来不少学者研究了草莓、黄瓜、杨树等根系分泌物中的酚酸类物质累积对土壤微生态环境的化感作用，设置酚酸类物质的初始含量为40～400 mg·kg-1干土不等[11-13]。李庆凯等[7]通过向土壤中添加外源对羟基苯甲酸、肉桂酸，研究了其对花生根部土壤养分、土壤酶活性及花生产量的影响，发现当两种酚酸类物质的初始含量达到40 mg·kg-1干土时，花生受到明显的毒害作用：花针期根部土壤碱解氮、有效磷、有效钾和土壤脲酶、蔗糖酶、中性磷酸酶活性均显著降低，外源添加对羟基苯甲酸和肉桂酸处理的每盆荚果产量分别降低了31.4%、35.8%，单株结果数分别降低了32.8%、35.5%。

利用合适作物与连作障碍作物进行间套作，可影响连作障碍作物的地下部化学生态机制，从而改善土壤条件。玉米蚕豆间作系统中玉米根系分泌物可促进蚕豆根系黄酮类化合物的合成，促进相关基因表达，增加蚕豆根系结瘤数量，从而增强蚕豆共生固氮能力[14]。非固氮型阔叶林和杉木混合种植可减少杉木根系化感自毒物质环二肽的释放，改善土壤微生物群落结构，促进土壤中化感自毒物质的降解，改善深层土壤中杉木根系的生长和分布，从而缓解杉木的连作障碍[15]。玉米花生间作是我国东北和华北地区一种常见的豆科作物与禾本科作物间作的种植方式，与花生连作相比，具有明显的增产增收优势。董智等[16]研究了玉米花生不同比例的间轮作种植方式，发现连作条件下花生的产量呈逐渐降低的趋势，而间作条件下花生的产量则逐年增加。姚远[17]研究发现，玉米花生不同比例间作均提高了连作花生土壤中细菌、放线菌和真菌的数量，花生根际土壤酶活性亦增强。其中，花生、玉米以4∶2间作模式是最有利于兼顾改良连作花生土壤和保证经济效益的间作模式。以上研究初步证实,玉米花生间作对缓解花生连作障碍存在一定的作用，但是具体作用机理还不够清楚。

间作作物种间的相互作用会影响其根系分泌物的特征，从而对整个间作系统的微生态环境产生一定影响[18]。有研究发现，玉米根系分泌物富含有机酸、氨基酸和糖分等营养物质[19]，亦含有丰富的苯并噁嗪类、黄酮类和酚类等化合物[20]，其在修复有机污染物土壤、增强土壤微生物活性、提高微生物多样性和控制土传病害中也发挥着重要作用[21]。以往玉米花生间作方面的研究多集中于作物农艺性状、产量形成特征、光合作用、养分利用及土壤肥力等方面，而较少涉及到作物根系分泌物，有关玉米根系分泌物是否会及如何影响连作花生土壤中酚酸类物质的化感作用，还未见报道。为排除田间其他因素的干扰，本研究通过添加玉米根系分泌物到含有肉桂酸、邻苯二甲酸及对羟基苯甲酸3种酚酸类物质的土壤中进行模拟培养，研究了玉米根系分泌物对土壤微生物量、微生物活性、酶活性及土壤有效养分含量的影响，旨在阐明玉米根系分泌物对连作花生土壤中酚酸类物质化感作用的影响机制，为玉米花生间作种植缓解花生连作障碍技术提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂

供试玉米品种为登海605号，由山东登海种业股份有限公司选育。

肉桂酸、邻苯二甲酸及对羟基苯甲酸均为国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯药品。

1.2 玉米根系分泌物的收集

取山东省农业科学院饮马泉试验农场玉米花生轮作地块0～30 cm土层土壤，风干过2 mm筛，将土壤混匀后装入花盆(口径30 cm，高25 cm)中，每盆装土15 kg，共计50盆，浇水润土后播种，每盆一穴，每穴两粒。出苗后，每穴保留健苗 1株，待玉米小喇叭口时期，每盆施用撒可富复合肥(N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15)5 g。于玉米抽雄期用水流缓慢的清水将玉米根系冲洗干净(尽量不要伤到根系)，再用去离子水冲洗2次，将玉米根系完全浸泡在5 mg·L-1的百里酚3 min后，移栽到5 L 0.5 mmol·L-1CaCl2溶液中，容器为10 L的烧杯。用纸箱包裹烧杯，使根部做避光处理，用气泵持续向培养液中通入空气，在室温且光照良好的条件下培养4 h。立即用500 mL CH2Cl2提取根系分泌物收集液2次，再将CH2Cl2提取液过0.45 μm的有机相滤膜，减压浓缩至干，称重，加入5 mL乙醇溶解，再用0.45 μm的有机相滤膜过滤，作为根系分泌物母液，于4 ℃避光保存备用。

1.3 试验设计

试验用土取自山东省日照市莒县连作10 a花生地块，于花生收获后采集，土壤类型为棕壤，质地为砂壤土。取0～20 cm耕层土壤，去除石砾、动植物残体等杂质后，过2 mm筛后混匀，一部分土壤储存于4 ℃冰箱中，用于酚酸类物质的检测[6]，另一部分土壤晾干备用。供试土壤pH值为5.24，有机质含量为11.7 g·kg-1，全氮、全磷、全钾分别为0.11、1.90和22.84 g·kg-1，碱解氮、有效磷和有效钾含量分别为45.92、30.76和94.67 mg·kg-1；供试土壤中肉桂酸、邻苯二甲酸和对羟基苯甲酸的本底值分别为2.44 mg·kg-1干土、5.96 mg·kg-1干土和4.05 mg·kg-1干土。

设置肉桂酸(A)、邻苯二甲酸(B)及对羟基苯甲酸(C)的处理浓度分别为40 mg·kg-1干土和80 mg·kg-1干土，玉米根系分泌物(MRE)的处理浓度为100 mg·kg-1干土。将晾干的连作花生土壤分装到塑料瓶中，每瓶(口径5 cm，高8.5 cm)装土100 g。设置CK、A1、A2、B1、B2、C1、C2、A1+MRE、A2+MRE、B1+MRE、B2+MRE、C1+MRE、C2+MRE共13个处理，详细处理方法见表1，酚酸类物质及玉米根系分泌物处理液配制前，各类物质先溶于一定量的无水乙醇，再稀释定容至1 L，无水乙醇的体积百分比为0.5%。将处理好的土壤分别用封口膜封口并留有小孔透气，保持含水量为20%(重量调节法)，每个处理9 瓶，25 ℃黑暗培养。

表1 试验设计Table 1 Experiment designation

1.4 土壤样品采集

分别于处理后5、10和15 d取样，每次随机取样3瓶，即3个重复。各个处理分别取出一部分新鲜土壤用于土壤微生物量和微生物活性的测定；其余土壤置于室内通风阴干，磨细后分别过2和1 mm孔径的筛子，分别用于土壤养分含量和酶活性的测定。

1.5 测定项目与方法

1.5.1土壤微生物量碳、氮和土壤呼吸强度测定

采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法[22]测定土壤微生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)和微生物量氮(microbial biomass nitrogen，MBN)的含量，浸提液中有机碳用全自动有机碳分析仪(Vario TOC，德国ELEMENTAR公司)测定，全氮采用凯氏法消煮-全自动定氮仪测定。微生物量碳、氮的换算系数分别为0.38和0.45[22]。采用室内密闭培养、碱液吸收滴定法测定土壤呼吸强度[22]。

1.5.2土壤酶活性测定 土壤酶脲酶采用苯酚钠比色法[23]测定，酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法[23]测定，蔗糖酶活性采用水杨酸比色法[23]测定。

1.5.3土壤养分含量的测定 土壤养分测定参考《土壤农化分析》[24]中的方法：采用碱解扩散法测定土壤碱解氮，钼酸铵显色法测定土壤有效磷，乙酸铵浸提—火焰光度法测定土壤速效钾。

1.5.4化感作用评价 化感作用效应敏感指数(response index，RI)采用Williamson 的方法[25]，公式如下。

RI=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T

式中，C为对照值，T为处理值。

当RI>0时，表示促进作用，当RI<0时，表示抑制作用。RI绝对值的大小代表化感作用强度。

1.6 数据统计与分析

采用Micorsoft Excel 2013处理试验数据，SPSS 16.0进行处理间各指标的差异显著性检验，采用 LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 玉米根系分泌物对含有酚酸类物质土壤微生物量和微生物活性的影响

土壤呼吸强度的高低与土壤微生物促进物质转化以及土壤动物和植物根系呼吸强度相关，可反应土壤微生物活性的强弱。不同处理的土壤微生物量和呼吸强度结果(表2)可知，酚酸类物质对土壤MBC、MBN含量和土壤呼吸强度均存在化感抑制作用(RI<0)，且浓度越高，抑制作用越强(P<0.05)。3次取样，土壤微生物量和呼吸强度所受到的化感抑制作用呈先增强后减弱的趋势，各处理在第10 d达到最强，以肉桂酸的化感作用最强。与对照相比，酚酸类物质处理的土壤MBC、MBN和土壤呼吸强度分别下降了17.81%～35.01%、14.24%～33.75%和13.58%～33.99%。

表2 不同处理的土壤微生物量和呼吸强度Table 2 Soil microbial biomass and respiratory intensity of different treatments

从整体来看，添加玉米根系分泌物均增加了3种酚酸类物质处理土壤的MBC、MBN含量和土壤呼吸强度，但仍低于同期对照；其中，在处理第5 d和10 d，均达到差异性显著(P<0.05)。整个培养时期，添加玉米根系分泌物的低浓度酚酸类物质处理对土壤MBC、MBN和土壤呼吸强度的化感指数影响较大，对应的化感指数分别平均下降39.33%、35.14%和39.56%。

3次取样，添加玉米根系分泌物对邻苯二甲酸的化感作用影响最大，对土壤MBC、MBN和土壤微生物活性的化感指数分别平均降低了34.07%、31.67%和34.36%。随着培养时间的延长，玉米根系分泌物对酚酸类物质化感作用的影响逐渐减弱，以处理第5 d影响最大。此时，与低浓度的酚酸类物质处理(A1、B1、C1)相比，添加玉米根系分泌物处理(A1+MRE、B1+MRE、C1+MRE)土壤MBC的化感指数分别下降了51.00%、64.13%和60.76%， MBN的化感指数分别下降了41.29%、55.69%和48.35%，土壤呼吸强度的化感指数则分别下降48.48%、57.51%和53.87%。

2.2 玉米根系分泌物对含有酚酸类物质土壤酶活性的影响

不同处理的土壤酶活性结果(表3)可以看出，随着培养时间的延长，对照土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶的酶活性均呈逐渐增加的趋势。与土壤微生物量和呼吸强度的变化规律类似，各类酚酸类物质均显著降低了3种土壤酶活性，且浓度越高，化感抑制作用(RI<0)越强(P<0.05)。同一取样时期初始含量相同的酚酸类物质处理之间，以肉桂酸的化感作用最强，邻苯二甲酸最弱。3次取样，酚酸类物质对土壤酶活性的化感抑制作用(RI<0)先增强后减弱，各处理在第10 d达到最强。此时，高浓度酚酸类物质处理的土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性分别比对照平均下降了24.11%、34.81%和23.32%。

在各取样时期，添加玉米根系分泌物均降低了3种酚酸类物质处理对土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性的化感指数。第5 d和10 d取样时，玉米根系分泌物显著增加了3种酚酸类物质处理的土壤酶(脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶)活性(P<0.05)。同一取样时期同种酚酸类物质处理之间，以低浓度处理化感指数的降幅较大；不同种类的酚酸类物质处理之间，以邻苯二甲酸的降幅最大。整个取样时期，玉米根系分泌物可使肉桂酸、邻苯二甲酸和对羟基苯甲酸对土壤酶活性的化感指数分别平均降低32.52%、36.89%和32.06%。

玉米根系分泌物对酚酸类物质化感作用的影响亦呈逐渐减弱的趋势，以处理第5 d的影响最大。此时，与对应浓度的酚酸类物质处理相比，添加玉米根系分泌物的高浓度酚酸类物质处理(A2+MRE、B2+MRE、C2+MRE)的土壤酶活性的化感指数分别平均下降21.61%、28.07%和23.97%；而含有玉米根系分泌物的低浓度酚酸类物质处理(A1+MRE、B1+MRE、C1+MRE)则分别平均下降36.33%、45.70%和40.15%。

2.3 玉米根系分泌物对含有酚酸类物质土壤养分含量的影响

不同处理的土壤养分含量结果(表4)可以看出，不同处理的碱解氮、有效磷、有效钾3种土壤养分含量的变化规律基本一致。酚酸类物质均显著降低了土壤碱解氮、有效磷和有效钾的含量，且浓度越高，化感抑制作用(RI<0)越强(P<0.05)。同一取样时期初始含量相同的酚酸类物质处理之间，以肉桂酸的化感作用最强。在整个取样时期，土壤养分含量所受到的化感抑制作用先增强后减弱，以处理第10 d最强。3次取样，酚酸类物质使土壤碱解氮、有效磷和有效钾的含量分别降低了10.70%～27.22%、12.85%～30.82%和8.05%～21.03%。

从整体来看，玉米根系分泌物均增加了各类酚酸类物质处理的土壤碱解氮、有效磷和有效钾的含量，降低了酚酸类物质对土壤养分含量的化感指数，以低浓度处理所受影响较大。其中在第5和10 d取样时，含有玉米根系分泌物的酚酸类物质处理的土壤养分含量显著增加(P<0.05)。3次取样，添加玉米根系分泌物后，邻苯二甲酸对应土壤养分含量的化感指数的降幅最大，平均降低了33.67%，而肉桂酸处理的降幅最小，平均降低了25.84%。

表3 不同处理的土壤酶活性Table 3 Soil enzymes activities of different treatments

在处理第5 d，玉米根系分泌物对各类酚酸类物质化感作用的影响最强，随后逐渐减弱。整个培养时期，与酚酸类处理相比，含有玉米根系分泌物处理的土壤碱解氮、有效磷和有效钾对应的化感指数分别可降低10.85%～57.79%、11.98%～59.71%和5.88%～54.17%。说明玉米根系分泌物亦可减弱酚酸类物质对土壤碱解氮、有效磷和有效钾的化感抑制作用。

表4 不同处理的土壤养分含量Table 4 Soil nutrients contents of different treatments

3 讨论

酚酸类物质是多种农作物根系分泌物的重要组分，在连作障碍中发挥着重要作用。随着花生连作年限增加，土壤中对羟基苯甲酸、香草酸和香豆酸的含量相应增加，连作10 a后3种酚酸总量可达11.09 mg·kg-1干土[5]。当酚酸类物质达到一定浓度时，可显著地影响土壤中微生物的生物量、多样性和群落结构，亦会增加特定病原菌毒素的产量[26]。另一方面，酚酸类物质结构中的酚羟基，可能对土壤微生物具有一定的毒害作用[27]。这些因素会造成土壤微生物的选择性适应，使某些病原真菌得到富集，从而降低土壤微生物数量和改变种群的平衡。本研究发现3种酚酸类物质均显著降低了土壤微生物量碳和氮的含量，抑制了土壤呼吸强度，且浓度越高，化感抑制作用越强，这与刘苹等[8]有关酚酸类化感物质对花生根际土壤微生物的研究结果相似。

玉米根系分泌物中含有一定浓度的活性有机碳和可溶性含氮物质，将其加入土壤后，会直接改变土壤碳、氮组分和含量，其中亦含有一些粘胶类物质，可改变土壤的颗粒状态，从而间接影响到土壤微生物碳、氮的含量[19]。另一方面，根系分泌物可直接促进土壤微生物活动和代谢，也对土壤微生物量和活性产生一定的影响[28]。适宜浓度的玉米根系分泌物为土壤中某些微生物的生存提供了必要的碳源和氮源，在一定程度上改变了土壤微生物的生态分布[19]。在本研究中，添加玉米根系分泌物均增加了3种酚酸类物质处理的土壤微生物量碳、氮含量和土壤呼吸强度，降低了酚酸类物质对土壤微生物量和呼吸强度的化感指数。根系分泌物中存在的抑菌物质可抑制土壤中非寄主病原菌的生长，从而减轻作物土传病害。张立猛等[20]报道了玉米在生长过程中可以通过根系分泌化合物到根际土壤中，抑制烟草疫霉菌的生长。孟玉芳等[29]研究发现玉米、大蒜、茴香和油菜4种作物根系分泌物可在短时间内迅速地杀死烟草疫霉的游动孢子，抑制其萌发。其中，玉米根系分泌物在最高浓度为2.59 mg·mL-1时，对疫霉休止孢子萌发的抑制率高达100%。土壤中微生物结构组成的改善和微生物群落功能多样性的提高，也在一定程度上加速了土壤酚酸类物质的降解。

宋慧等[30]通过向盆栽小豆根际土壤添加不同浓度外源邻苯二甲酸和肉桂酸，发现小豆根际土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶和脲酶活性均呈下降趋势。母容等[31]研究发现，一定浓度的阿魏酸和对羟基苯甲酸等酚酸类化合物可通过抑制土壤中氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌及土壤脲酶、蛋白酶活性，从而降低土壤铵态氮、硝态氮和有机氮的含量，进而影响土壤氮素转化。本研究发现，肉桂酸、邻苯二甲酸及对羟基苯甲酸3种酚酸类物质处理均显著降低了土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性，土壤养分含量(碱解氮、有效磷、有效钾)亦显著降低，且浓度越高，降幅越大，这与前人研究结果[13,30]基本一致。酚酸类物质进入土壤后，可导致土壤微生物胞内酶、胞外酶比例失调或改变酶的构象，从而影响土壤酶活性[12]。其次，酚酸类物质也可直接作用于土壤酶，从而降低其活性。土壤酶活性的减弱进而会降低土壤有效养分的含量。此外，酚酸类物质可能会降低土壤pH值，从而影响土壤酶活性[32]。但是李庆凯[33]研究发现，当土壤中肉桂酸、邻苯二甲酸和对羟基苯甲酸的初始含量为15～90 mg·kg-1干土，且于室内培养3～45 d时，其pH均不存在显著变化。因此，推断本研究中土壤pH的变化不是导致土壤酶活性降低的主要原因。

作物间作体系中地下部的相互作用影响着土壤理化性质，其中根系分泌物发挥着重要作用。左元梅等[34]认为两种作物之间根系接触并不是关键因素，关键是间作作物通过向土壤中释放根系分泌物而相互影响，玉米花生间作系统中无论是玉米根系与花生根系直接接触还是两者根系用尼龙网隔开，玉米的根系分泌物都能进入到花生根际，从而影响花生铁营养的作用。本研究发现，添加玉米根系分泌物均增加了各取样时期含有酚酸类物质的土壤脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性，降低了肉桂酸、邻苯二甲酸和对羟基苯甲酸对3种土壤酶活性的化感指数。苑亚茹等[35]研究发现外源添加低分子量的糖类、有机酸等分泌物于黑土中可在短期内显著促进>0.25 mm大团聚体，尤其是>2 mm团聚体的形成，显著增强了土壤团聚体的稳定性。宋日等[36]认为玉米根系分泌物可显著提高黑土中多糖含量、水稳性大团聚体比例、水稳性团聚体稳定性。玉米根系分泌物中的糖类、氨基酸和有机酸等成分可在一定程度上互补和平衡酚酸类物质处理的土壤养分。土壤结构的改善和养分的平衡维持了土壤微生物的多样性，提高了土壤酶活性和养分含量。另外，玉米根系分泌物亦可活化土壤难溶性无机养分或分解土壤中的有机成分，也在一定程度上提高了土壤有效养分[34,37]。

添加到土壤中的酚酸类物质和玉米根系分泌物可被土壤吸附或在土壤微生物作用下转化为其他物质或被微生物吸收，从而使得其在土壤中的浓度发生变化，不同化感物质在土壤中降解速率存在差异[9]。本研究中，肉桂酸对土壤各指标的化感抑制作用最强，这可能是肉桂酸在土壤中的降解速率较慢所致。另外，酚酸类物质对土壤微生态环境的作用效果与其种类亦有关。随着培养时间的延长，3种酚酸类物质对土壤的化感抑制作用均呈先增强后减弱的趋势，而玉米根系分泌物对酚酸类物质化感作用的影响呈逐渐减弱的趋势，这可能是玉米根系分泌物在土壤中的降解速率较快所致。本研究发现，添加玉米根系分泌物后，邻苯二甲酸和低浓度酚酸类物质处理对土壤微生态环境的化感抑制作用受影响较大，说明玉米根系分泌物对酚酸类物质化感作用的效果与酚酸类物质的种类和含量亦存在一定的关系。玉米根系分泌物对含有多种酚酸类物质混合物土壤微生态环境的影响，有待于进一步研究。