南极独角雪冰鱼(Chionodraco hamatus)miR-204对斑马鱼胚胎血管发育的作用机制研究

陈祺, 颜帅帅, 许强华,2,3,4*

(1.上海海洋大学海洋科学学院, 上海 201306; 2.上海海洋大学大洋渔业资源可持续开发省部共建教育部重点实验室, 上海 201306; 3.国家远洋渔业工程技术研究中心, 上海 201306;4.远洋渔业协同创新中心,上海 201306)

MicroRNAs广泛存在于各种动植物基因组中，其长度约为21～23 nt，在物种进化过程中保持高度同源性和保守性，并且在物种中具有严格的表达特异性和时序性。到目前为止，已有数以千计的microRNAs在果蝇、线虫、小鼠和人等多个物种中被发现[1]。研究显示，microRNAs是一类重要的非编码RNA, 不仅能在转录后mRNA水平上起调控作用，也能在转录水平介导很多关键的生理进程和病理过程，包括细胞增殖、细胞命运决定、细胞分化、细胞代谢、细胞凋亡等[2]。microRNAs在血管发育中也起重要作用，主要通过调控其靶基因来调控血液血管系统中的血管平滑肌细胞和血管内皮细胞，从而抑制血管发育或使血管增生。

血管是生物体生存密不可分的一个器官，研究生物体血管发育能更进一步了解血管，并且能为治疗血管的相关疾病提供一定基础。虽然目前有众多与血管发育相关的microRNAs被报道，但是仍有许多与血管发育相关的microRNAs未被发现。独角雪冰鱼(Chionodracohamatus) 是生活在南极深海零度以下水域的底栖性鱼类，其血液中不含血红蛋白和功能性血红细胞。与含血红蛋白的南极鱼相比，独角雪冰鱼的心脏明显增大，血管明显变粗[3]。本课题组前期将独角雪冰鱼与相同生境下其他近缘南极鱼血管中microRNAs的表达进行对比，发现包括miR-204在内的多个microRNAs的表达存在显著差异，推测miR-204可能参与了南极独角雪冰鱼的血管发育调控。

目前关于miR-204调控血管发育的研究较多，Jakob等[4]研究发现，miR-204可以通过调控促血管生成素-1(angiopoienin-1)来调控小鼠角膜新生血管的发育。Cui 等[5]研究发现，miR-204-3p调控纤维连接蛋白1(fibronectin 1，FN1)抑制miR-204表达，从而阻塞FN1的附着能力，促进血管内皮细胞的增殖。在钙化性主动脉瓣的疾病研究中，沉默表达牛磺酸上调基因1(taurine upregulated gene 1，TUG1)会增加miR-204-5p的表达进而调控runt-related transcription factor 2(Runx2)的表达从而促进成骨分化[6]。而在A549细胞中转染miR-204 mimics，会使血管内皮生长因子和血小板生长因子表达降低[7]。不仅如此，在胃癌研究中，miR-204能调控JAK2-STAT3信号通路从而降低血管生成[8]。这些研究大多数都在细胞中进行，未能从机体层面进行研究。本研究拟在鱼体上探究miR-204在血管发育初期对血管生成的作用，进一步探究miR-204对血管生成的调控机制。

本研究利用模式生物斑马鱼(Barchydaniorerio)，通过注射miR-204 antagomir抑制miR-204的表达，观察斑马鱼胚胎血管发育情况，并对miR-204的靶向基因进行预测及验证，探究miR-204在血管发育中的功能及调控机制，为后续揭示南极独角雪冰鱼血管补偿性增生机制提供一定的基础，有助于探索脊椎动物血管发育的作用机制，以期未来能应用于与血管相关的疾病治疗。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生型斑马鱼(AB型)以及转基因斑马鱼(kdrl: EGFP)在斑马鱼饲养实验室(上海海生生物实验设备有限公司)的封闭超滤超净化水系统中饲养，循环水维持在28 ℃，光周期14 h/10 h(光照/黑暗)。

293细胞是转染腺病毒的人肾上皮细胞系，293T细胞则是由SV40大型T抗原转染293细胞后得到。293T细胞容易转染，且传代速度快。采用含谷氨酰胺的 DMEM 高糖培养基进行培养，配以10%的胎牛血清以及1%的双抗充分混合，培养条件为 37 ℃、5% CO2。当细胞达到对数生长期时，可进行下一步试验。

1.2 仪器和试剂

主要仪器包括：电子天平(BSA-223S，赛多利斯科学仪器有限公司)、体式显微镜(SMZ445，尼康仪器有限公司)、离心机(Centrifuge 5424R，Eppendorf)、磁力搅拌器(90-18，上海梅颖仪器仪表制造有限公司)、超纯水净化系统(P2PA7491，Millipore)、恒温混匀仪(Eppendorf)、恒温培养箱(DNP-9082，上海精宏实验设备有限公司)、电泳凝胶成像系统(Alpha Innotech)、PCR仪(S1000，BIO-RAD)。

主要试剂包括：miR-204 antagomir、NC(上海吉玛基因)；T4连接酶、PVDF膜、显影液(Thermo Fisher)；GFP、Actin(GenTex)；PMD18-T载体(Takara)；内切酶(NEB)；感受态细胞(天根生化科技有限公司)；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(Omega)；胎牛血清(Gibico)；DMEM高糖培养基(Hyclone)；转染试剂(QIAGEN)；蛋白胨、酵母粉、甲醇、氯化钠、甘氨酸、Tris、脱脂奶粉、氨苄抗生素、卡那抗生素、20XPBS、蛋白marker、SDS、质粒小提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.3 质粒构建

1.3.1目的序列设计 通过比对斑马鱼、罗非鱼、人、小鼠的基因组发现，miR-204的种子序列高度保守(表1)。运用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRBase(http://www.mirdb.org/)、starBase(http://www.starbasemn.org/)网站预测miR-204潜在靶基因，挑选与血管发生相关的5个候选基因，分别为sprouty-related EVH1 domain containing1 (spred1)、transforming growth factor beta1a (tgfβ1a)、vascular cell adhesion molecule 1b (vcam1b)、NADPH oxidase 4(nox4)、tribbles pseudokinase 3 (trib3) 。从NCBI数据库分别获得上述5个候选基因的3′UTR序列，根据所获得的3′UTR 序列与miR204的结合位点, 由 Primer 5.0 软件设计得到特异性引物序列，同时选取适合的酶切位点(表2)。分别构建5个候选基因的pmir-GLO-3′UTR质粒，运用双荧光素报告酶基因检测后选定trib3(CU571319.15)作为最终研究基因。

表1 miR-204在物种间的保守性Table 1 Conservation of miR-204 among species

表2 引物序列与限制性内切酶Table 2 Primer sequence and restriction enzyme

1.3.2质粒构建 引物合成后，进行PCR扩增。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后进行割胶回收。取4 μL胶回收产物，加入5 μL Solution以及1 μL T载体16 ℃连接4 h，随后进行转化。转化后，挑取单克隆，37 ℃摇床进行培养，用通用引物进行PCR后进行测序。结果用 Vector NTI 7.0 软件进行序列比对，测序正确的单克隆用 50 mL 离心管进行扩大培养，随后进行质粒抽提。提取后的质粒用限制性内切酶SacⅠ、SalⅠ(pmirGLO-TRIB3-3′UTR质粒)以及NotⅠ、MfeⅠ(Tol2-TRIB3-3′UTR质粒)进行酶切反应。酶切产物 进行1%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，分别与已进行酶切后的pmirGLO和Tol2质粒在 16 ℃过夜连接。转化后，挑取单克隆，37 ℃摇床培养，用表2所述引物进行PCR扩增后进行测序。用 Vector NTI 软件对测序序列进行比对。测序正确的单克隆用 50 mL 离心管进行扩大培养，用质粒提取试剂盒进行质粒中提，得到最终质粒。

1.4 斑马鱼血管观察

将性成熟的斑马鱼于前一夜进行交配，取其产的受精卵，使用显微注射技术将1 nL 的miR-204 antagomir(50 μmol·L-1)和NC(50 μmol·L-1)(上海吉玛制药技术有限公司)，注射到转基因斑马鱼(kdrl：EGFP)一细胞期的受精卵内，每组分别各注射100枚受精卵。以未注射的斑马鱼受精卵(CK)为对照，置于28 ℃环境下培养5 d后进行拍照观察斑马鱼胚胎血管发育情况。

1.5 细胞转染及酶活检测

接种293T细胞于24孔板中，每孔加入配制好的完全培养基500 μL 以及50 μL 处于对数生长期的293T细胞，置于37 ℃培养箱中过夜培养。待293T细胞密度约为80%时，取400 ng pmirGLO-TRIB3-3′UTR质粒+ miR-204mimics (处理组，T)、400 ng pmirGLO-TRIB3质粒+ NC(阴性对照组，NC)、400 ng pmirGLO-TRIB3-3′UTR质粒 (空白对照组，CK)加入无血清的基本培养基中进行共转染，短暂旋涡混匀，立即加入 1.5 μL 转染试剂。室温放置 15 min 后逐滴加至细胞中。转染6 h后吸出无血清的基本培养基，每孔加入500 μL 新鲜完全培养基。培养26 h后收集细胞。

双荧光素酶报告系统一般用来做miRNA靶标鉴定。采用 Dual-Luciferase©报告基因检测试剂盒(Promega, USA)检测荧光素酶活性，并计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值(Firefly Luc/Renilla Luc)。

1.6 TRIB3蛋白的荧光表达及蛋白免疫印迹

将性成熟的斑马鱼于前一夜进行交配，取其产的受精卵，使用显微注射技术将1 nL 的miR-204(50 μmol·L-1) 和NC(50 μmol·L-1)分别与100 ng 的Tol2-TRIB3-3′UTR共注射到一细胞期的斑马鱼受精卵内，空质粒(CK)单独注射至受精卵中，每组分别各注射50颗受精卵。24 h后在荧光显微镜进行拍照观察GFP荧光强度变化。并收集受精卵，用于荧光蛋白表达的检测。

将收集的斑马鱼受精卵，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次，然后用RIPA缓冲液(Beyotime，中国)和蛋白酶抑制剂PMSF(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)在冰上裂解30 min，提取GFP蛋白质。使用8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶从每个样品中分离相同量(100 μg)的蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜(Millipore，Billerica，NY，USA)上。用含5%脱脂牛奶的1%PBST溶液封闭后，将膜在室温下与抗-GFP(1∶2 000，GT859; GeneTex)一抗孵育1 h，用1×PBST洗涤3次，每次5 min，并在室温下与二抗(1∶2 000)一起温育1 h。使用BioRad Western印迹系统(Hercules，CA，USA)使蛋白质条带可视化。

1.7 数据分析与处理

试验数据利用Microsoft Excel 2010进行统计分析，使用GraphPad Prism 7.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 注射miR-204对斑马鱼血管的影响

在转基因斑马鱼(kdrl：EGFP)中注射miR-204 antagomir(T)及阴性对照(NC)后，用荧光显微镜观察斑马鱼胚胎血管发育情况，结果(图1)发现，与NC、CK的受精卵相比，注射miR-204的斑马鱼躯干部毛细血管增多，节间血管增多。结果表明，抑制miR-204使斑马鱼胚胎毛细血管增加，miR-204可能参与斑马鱼胚胎血管发育的调控。

注：白色箭头指毛细血管增生。Note: The white arrows indicate capillary proliferation.图1 不同处理的斑马鱼胚胎血管发育情况Fig.1 Vascular development of zebrafish embryos in different treatments

2.2 共转染miR-204和trib3后酶活变化

共转染miR-204和trib3至293T细胞后，检测荧光虫荧光素酶活性以及海肾荧光酶活性，随后计算萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值结果(图2)发现，处理T与NC和CK相比，其相对酶活均极显著下降，表明注射miR-204后斑马鱼的TRIB3活性降低，即miR-204对trib3有抑制作用。

注： **表示处理间在P<0.01水平差异具有统计学意义。Note: **indicate extremely significant difference between treatments at P<0.01 level.图2 不同处理方式的双荧光素酶活比值Fig.2 Activity ratio of double luciferase under different treatments

2.3 共注射miR-204与trib3后GFP蛋白强度变化

为进一步探究miR-204对trib3的抑制作用，构建了tol2-EGFP-TRIB3质粒，并与50 μmol·L-1miR-204(T)、50 μmol·L-1NC(NC)共同注射至野生型斑马鱼一细胞期受精卵中，空质粒(CK)单独注射至受精卵中。24 h后的GFP荧光强度结果(图3A)显示，miR-204与tol2-EGFP-trib3质粒共同注射的GFP荧光强度显著低于阴性对照和空白对照组。GFP蛋白的Western blot分析(图3B)表明，miR-204与tol2-EGFP-trib3质粒共同注射后的GFP蛋白表达量显著低于空白对照和阴性对照组，进一步表明miR-204能够下调TRIB3的表达。而trib3参与小鼠大动脉斑块数量和面积调节[12]，以及与大鼠血管纤维化有关联[13]。由此推测miR-204可能通过调控trib3进而调控斑马鱼胚胎血管的发育。

3 讨论

斑马鱼作为模式生物，因其饲养容易、性成熟期短、卵易于观察等原因，在众多研究领域中得以普遍应用；将斑马鱼作为研究模型尤其广泛应用于鱼类的遗传发育研究中[8]。本研究将miR-204 antagomir注射至斑马鱼胚胎一细胞期，观察斑马鱼胚胎血管变化，发现注射miR-204后斑马鱼胚胎躯干部毛细血管增生。针对miR-204进行了潜在靶基因预测后，选定trib3为miR-204潜在靶基因。

A：GFP蛋白荧光强度；B：GFP重组蛋白表达印迹。A: Fluorescence intensity of GFP protein; B: Western blot of GFP recombinant protein.图3 不同处理的斑马鱼胚胎GFP荧光蛋白表达检测Fig.3 GFP fluorescence protein expression in zebrafish embryos under different treatments

TRIB3最初被认为是抑制果蝇胚胎和生殖细胞有丝分裂的假激酶[9]。根据报道，细胞在缺氧的胁迫条件下，会诱导TRIB3的表达[10]。在小鼠中，敲降TRIB3会使血糖和肝糖明显降低[11]。在小鼠中，沉默表达TRIB3会使大动脉斑块数量和面积减少[12]。在糖尿病大鼠模型中，其中有血管纤维化的大鼠TRIB3表达量增高，被认为TRIB3与糖尿病血管纤维化有关联[13]。TRIB3基因还被证明与胰岛素抗性[14]和颈动脉粥样硬化[15]有关。本研究将miR-204与pmir-trib3-3′UTR质粒共转染至293T细胞，并将miR-204与trib3的质粒共注射至斑马鱼一细胞期中，结果都显示miR-204对trib3有显著抑制作用。因此推测，miR-204通过抑制trib3的表达从而调控斑马鱼胚胎血管发育。本研究筛选出miR-204的靶基因为trib3，并进行了验证，为阐明miR-204在斑马鱼胚胎血管发育中的调控机制提供参考依据。