黄野螟谷胱甘肽硫转移酶Sigma 1基因的鉴定及表达模式

程 杰，王春燕，林 同

(华南农业大学 林学与风景园林学院，广东 广州 510640)

土沉香(Aquilariasinensis(Lour1)Gilg)亦称白木香，为瑞香科沉香属植物，是我国生产沉香的唯一植物资源，其经济价值很高，现已被列为国家2级珍稀濒危保护植物。黄野螟(HeortiavitessoidesMoore)属鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，在我国广泛分布于广东、广西、海南和云南等南方各省以及香港特别行政区。黄野螟是土沉香的重要害虫，以食叶危害大，发生时常把叶片吃光，使其变成秃稍，严重影响了植株的生长[1-3]。

谷胱甘肽硫转移酶(GSTs，EC 2.5.1.18)属于多功能酶，广泛存在于真核细胞及原核细胞中[4]。GSTs可以分为15个家族(Alpha、Beta、Delta、Epsilon、Kappa、Lambda、Mu、Omega、Pi、Phi、Rho、Sigma、Theta、Tau和Zeta)[5]，而大部分昆虫GSTs可分为6个家族(Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta)。其中Delta和Epsilon是昆虫特异的家族[6]。GSTs不仅成员众多，而且功能复杂。有研究表明，GSTs功能涉及内源与外源化合物的脱毒反应、氧化应激、胞内运输以及激素合成[7]。在昆虫中，GSTs功能涉及两大部分，一部分功能是作为配体结合蛋白结合有毒物质，从而行使解毒功能；另一部分功能是催化谷胱甘肽巯基和一些亲电性有毒物质(如过氧化物、杀虫剂及醌类化合物等)进行轭合反应[8]。一些研究表明，昆虫GSTs在杀虫剂代谢中起到关键作用[9-10]。

本研究基于黄野螟成虫转录组文库数据，经过Blast同源比对，获得黄野螟谷胱甘肽硫转移酶Sigma家族Sigma1基因cDNA全长，命名为HvGSTs1，首次对其进行生物信息学分析以及不同发育时期不同组织部位表达分析，以期为以后研究黄野螟Sigma家族GST的生理功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

黄野螟卵及幼虫采自广东省化州市平定镇(22°01′N，110°25′E)，在人工气候箱设置温度为27 ℃、相对湿度为75%、光照周期L/D=16 h/8 h条件下，用新鲜的土沉香叶片饲养至蛹及成虫。分别收集黄野螟各虫态虫体各5头(卵、幼虫、蛹、成虫)经清洗、消毒、麻醉，将样品置于无菌去酶的EP管液氮速冻后，放于-80 ℃冰箱保存。选取30头4龄幼虫及30头2日龄成虫用上述方法解剖并获得幼虫头、体壁、脂肪体、中肠，成虫头、胸、腹、足、翅。

1.2 主要试剂

(OMEGA公司)总RNA提取试剂盒(E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ)；(TaKaRa公司)反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser)及实时荧光定量试剂盒(SYBR premix Ex TapTM)。

1.3 总RNA提取和反转录

各样本总RNA的提取严格按照E.Z.N.ATMTotal RNA KitⅡ提取试剂盒说明书进行，各样本的RNA质量使用1.5% 琼脂糖凝胶电泳进行检测，各样本的RNA浓度使用微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000)进行检测，符合后续试验要求的-80 ℃低温保存。取2 μL RNA并使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒合成第1链cDNA。

1.4 基因克隆

从黄野螟成虫转录组文库(NCBI SRA登录号：SRX3035102)中克隆出GSTs1基因完整编码序列。

1.5 生物信息学分析

NCBI ORF Finder工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)用于ORF搜索；ExPASy-ProtParam工具(http：//web.expasy.org/protparam/)用于蛋白理化性质分析；SignalP-4.1工具(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)用于信号肽预测；NetPhos 3.1 工具(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)用于蛋白磷酸化位点预测；SubLoc v1.0工具(http：//www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/)用于亚细胞定位预测；TMHMM v.2.0工具(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)用于跨膜区预测；COILS工具(http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)用于卷曲螺旋预测；SOPMA工具(https：//npsa-prabi.ibcp.fr)用于蛋白二级结构预测；SSpro 4.0 工具(http：//beta.swissmodel.expasy.org/)用于蛋白空间结构预测；NCBI 蛋白Blast工具(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)用于获得蛋白同源序列；ClustalX工具(http：//www.clustal.org/download/1.X/ftp-igbmc.ustrasbg.fr/pub/ClustalX/)用于对齐同源蛋白。在MEGA 4.0工具中使用邻接法(NJ)构建系统发育树。DNAMAN工具(v6.0.3.48)用于氨基酸同源性比对。

1.6 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR反应体系：2.0 μL的cDNA模板，10.0 μL的SYBR Premix ExTaq，上下游引物各0.4 μL，7.2 μL的ddH2O。利用Primer premier 5.0设计本试验中所需要的引物(表1)。实时荧光定量PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃解链10 s，60 ℃延伸20 s；共进行40个循环。实时荧光定量PCR内参基因：微管蛋白(α-tubulin)基因(GenBank登录号：MG132200)。实时荧光定量PCR阴性对照：无菌超纯水。实时荧光定量PCR表达量测定：以黄野螟GSTs1在卵期的表达量为标准参量来测定其各虫态的表达量，以黄野螟GSTs1在4龄幼虫的表达量为标准参量来测定其在幼虫各组织的表达量，以黄野螟2日龄成虫GSTs1的表达量为标准参量测定其成虫各部位的表达量，每个样本3次重复。使用2-ΔΔCt法测定每个cDNA模板GSTs1基因的相对表达水平。上述数据统计分析使用Excel和SPSS 18.0软件的Duncan′s单因素方差分析法(ANOVA)。

表1 所用引物Tab.1 Primers used

2 结果与分析

2.1 基因序列及编码氨基酸序列分析

通过对黄野螟成虫转录组文库(NCBI SRA登录号：SRX3035102)进行筛选，再经NCBI核酸序列数据库在线Blast同源性比对后，筛选出一条具有完整ORF的序列，鉴定其属于谷胱甘肽硫转移酶Sigma家族，为黄野螟谷胱甘肽硫转移酶Sigma1基因，命名为HvGSTs1(GenBank：MF521977)，全长1 054 bp，其中开放阅读框长度为615 bp，共编码204个氨基酸(图1)，推测的编码蛋白质分子量23.198 ku，等电点pI为5.24，不稳定系数为47.61，脂肪系数80.88。疏水性分析表明，该蛋白为亲水蛋白。无信号肽和跨膜区。蛋白磷酸化位点预测表明，HvGSTs1蛋白含有丝氨酸磷酸化位点9个，苏氨酸磷酸化位点2个，酪氨酸磷酸化位点6个。

方形符号用于标注丝氨酸(Ser)磷酸化位点；圆形符号用于标注苏氨酸(Thr)磷酸化位点；三角符号用于标注酪氨酸(Tyr)磷酸化位点；起始密码子ATG及终止密码子TAA以加粗表示。The phosphorylation sites of Ser are indicated in square. The phosphorylation sites of Thr are indicated in circle.The phosphorylation sites of Tyr are indicated in triangle. The initiation and termination codons are indicated in bold font.

2.2 亚细胞定位及功能结构域

亚细胞定位显示，GSTs1蛋白定位在细胞质的可能性最大，为52.2%，推测该蛋白存在于细胞质中。使用NCBI Conserved Domains Search工具对HvGSTs1蛋白保守结构域进行预测，结果表明，HvGSTs1属于GST Sigma型蛋白(图2)，8-73位氨基酸为GST_N_Sigma_like结构域，属于thioredoxin_like superfamily；83-186位氨基酸为GST_C_Sigma_like结构域，属于GST_C_family superfamily。

图2 HvGSTs1蛋白保守区预测Fig.2 Conserved domains of HvGSTs1 protein

2.3 高级结构

HvGSTs1蛋白二级结构预测使用SOPMA软件，结果表明，该蛋白的二级结构由α 螺旋(50.00%)、无规则卷曲(29.90%)、延伸链(11.76%)、β 转角(8.33%)构成。以此推测该蛋白的主要二级结构由α螺旋和无规则卷曲构成。空间结构分析使用SSpro 4.0 工具(图3)，结果表明，HvGSTs1蛋白具有1个谷胱甘肽的结合区域，即N端结构域；还具有1个识别并结合底物区域，即C端结构域。

2.4 同源序列比对及系统发育树

基于黄野螟和其他6种鳞翅目昆虫GSTs Sigma 1氨基酸序列同源性比对结果表明(图4)，黄野螟与二化螟(Chilosuppressalis)同源性最高，为76%，与家蚕(Bombyxmori)、菜粉蝶(Pierisrapae)、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、斜纹夜蛾(Spodopteralitura)、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)同源性分别是73%，74%，70%，71%，70%。黄野螟与其他6种鳞翅目昆虫的GSTs Sigma 1氨基酸序列构建的系统进化树结果表明(图5)，黄野螟与二化螟遗传距离最近，与同源性分析的结果一致。

图中1、2、3、4分别表示α螺旋、β转角、延伸链、无规则卷曲。N、C表示蛋白N端和C端。The alpha helix，beta turn，extended strand，random coil are denoted by1，2，3，4 respectively. N and C indicate N-terminal and C-terminal ends of the protein，respectively.

图 4 不同鳞翅目昆虫GSTs1的多序列比对Fig.4 Multiple sequence alignment of GSTs1 from different Lepidoptera insects

图5 不同昆虫GSTs1蛋白的系统发育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of GSTs1 proteins from other species

2.5 HvGSTs1基因的表达

用RT-qPCR分析了黄野螟不同发育阶段、幼虫不同部位及成虫不同部位HvGSTs1相对表达量，结果表明，在黄野螟4个不同发育阶段均检测到HvGSTs1的表达。具体而言，HvGSTs1的相对mRNA水平主要表达在蛹期，是卵期的958%，在其他发育阶段检测到相对较低的mRNA表达水平(P<0.05)(图6)。在幼虫各部位的脂肪体中发现最高的HvGSTs1表达水平(P<0.05)，是对照的225%，而在幼虫的中肠中发现最低的HvGSTs1表达水平(P<0.05)，是对照的20%，头及表皮基因表达量都显著低于对照(P<0.05)，分别是对照的50%和61%，幼虫4个不同部位之间基因表达差异显著(P<0.05)(图7)。HvGSTs1基因在成虫的腹部和胸部表达量最高，分别为对照的447%和325%，在足表达量最低，为对照的28%，该基因在成虫的5个部位的表达水平均有显著差异(P<0.05)(图8)。

图中数据代表3个生物重复的平均值±标准误差。基于ANOVA分析，柱上不同小写字母表明差异显著(P<0.05)。图7-8同。

The data represent mean ±SD of 3 biological repeats. Small letters indicate significant differences atP< 0.05 level according to ANOVA.The same as Fig.7-8.

图6黄野螟不同发育阶段HvGSTs1表达谱
Fig.6ThetemporaltranscriptpatternsofHvGSTs1

图 7 HvGSTs1基因在黄野螟幼虫中的表达Fig.7 The spatial expression patterns of HvGSTs1 in larvae

图 8 HvGSTs1基因在黄野螟成虫中的表达Fig.8 The spatial expression patterns of HvGSTs1 in adults

3 讨论

GSTs属于超基因家族酶，它可以催化机体内还原性谷胱甘肽(GSH)与外源性及内源性有毒物质发生亲电子基团反应，反应后使有毒物质更容易排出体外，降低机体遭受的损害，是生物体内一类重要的Ⅱ相解毒酶[11]。基于细胞中坐落位置，将GSTs分为三大类型，即微粒体型(Microsomal GSTs)、线粒体型(Mitochondrial GST)和胞质型(Cytosolic GSTs)[12]。其中，胞质型GSTs是研究最多的类型，通常所指的谷胱甘肽硫转移酶即为此类。胞质型GSTs属于二聚体蛋白，由同源或者异源亚基组成，每个亚基200～250个氨基酸，分子量大小为20～28 ku。不同家族的GST亚基在氨基酸序列上已经高度进化，但每个亚基都由2个结构域组成：N-末端结构域(结构域Ⅰ)和C-末端结构域(结构域Ⅱ)。N-末端结构域含有G位点，可以与GSH结合，C-末端结构域含有H位点，可以亲电子底物结合，二者构成了GSTs的催化反应活性中心[13-14]。黄野螟GSTs1和其他物种GSTs结构一样，NCBI对其蛋白保守域预测显示，在第8-73位为保守的N端结构域，在第83-186位为C端结构域。

随着杀虫剂的使用范围越来越广、使用剂量越来越高，据统计，约500种昆虫对不同的杀虫剂产生了抗性[15]。近年来，对于昆虫GTSs的研究主要集中在杀虫剂抗性方面[16-18]，不同的杀虫剂处理后，GSTs可以催化谷胱甘肽与杀虫剂的特殊基团结合从而进行脱毒作用(脱氯化氢作用等)[19]。在昆虫GSTs 6个家族中，Delta和Epsion是昆虫特有的GSTs，大量研究表明，二者参与了对杀虫剂(例如对有机磷、有机氯杀虫剂及拟除虫菊素类杀虫剂)的脱毒作用[20-21]。也有研究表明，在昆虫中，Sigma和Omega家族GSTs对内外源的有毒物质，包括对杀虫剂也有脱毒作用[22-23]。除此之外，有报道指出，在果蝇(Drosophilamelanogaster)和家蝇(Muscadomestica)飞行肌中，Sigma型GSTs与肌钙蛋白H有密切联系，此外，昆虫Sigma GSTs还具有催化活力[24]。

不同昆虫在不同发育时期其体内的GSTs活性不同，例如在甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)中，SeGSTs1基因mRNA相对表达量在3龄幼虫时期最高[25]，而在扶桑绵粉蚧(Phenacoccussolenopsis)中，PsGSTz1基因在1龄幼虫中的表达量最高，是其成熟雌虫的2.65倍[26]。黄野螟GSTs1在不同发育阶段均有表达，表明在黄野螟整个生命过程中均起重要作用。HvGSTs1在蛹期的表达量最高，是卵期的958%，推测HvGSTs1可能参与黄野螟羽化，与赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)中TcGSTd1和TcGSTd2表达模式类似[27]。黄野螟GSTs1基因在4龄幼虫不同部位中均有表达，其中在脂肪体中相对表达量最高，在稻纵卷叶螟[28]、棉铃虫[29]、美洲棉铃虫[30]中同样是脂肪体GSTs活性最高，原因是脂肪体是昆虫中重要的解毒场所，同时也是许多生理代谢作用进行的场所[31]。黄野螟GSTs1基因在2日龄成虫头、胸、腹、足、翅都均有表达，在腹部及胸部中表达量最高，推测原因可能是由于腹部作为黄野螟成虫生殖及代谢中心，胸部作为运动中心，会消耗大量能量并产生内源性有毒物质。HvGSTs1在上述部位大量表达有助于黄野螟抵御体内有毒物质的侵害。

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