盐胁迫下花生幼苗期相关性状的QTL分析

苗华荣，杨伟强，胡晓辉，张胜忠，崔凤高，陈 静

(山东省花生研究所，山东 青岛 266100)

栽培种花生(A.hypogaeaL.)为异源四倍体，是世界上重要的油料作物，广泛分布于世界半干旱区域。2010-2014年，全球种植面积为25.27百万hm2，产量达到42.27百万t[1]。分子遗传图谱广泛应用于基因定位、图位克隆以及分子标记辅助育种。目前，遗传图谱通常包含RFLP、AFLP、SSR、SNP标记。自2001年以来，共27个四倍体花生遗传连锁图谱公布，其中23个遗传图谱是基于栽培种花生构建的，4个是栽培种花生与合成四倍体花生构建的[2-17]。基于遗传图谱，花生重要性状的QTL定位取得了一定进展，张新友[18]运用栽培种RIL群体和F2群体定位了与产量、品质等性状相关的62个QTL；Shirasawa等[12]基于栽培种花生遗传图谱，获得了与开花日期、分枝角度、主茎高、荚果长、荚果厚、荚果宽的QTL；Wang等[19]利用栽培种花生Tifrunner×GT-C20构建的群体定位到与番茄斑萎病毒(TSWV)、叶斑病相关的QTL；Huang等[8]利用RIL群体对3个环境下花生株高进行了QTL分析；Pandey等和Wang等[9，20]分别利用SunOleic97R×NC94022和Tifrunner×GT-C20构建的RIL群体对花生脂肪酸和油脂含量进行了QTL分析；成良强等[21]利用富川大花生×ICG6375构建的F2群体和F3家系对花生主茎高和总分枝数进行了QTL分析。

目前，花生耐盐性研究主要集中在不同耐盐鉴定方法的探索[22-23]、花生耐盐性种质资源鉴定和评价[24]、盐胁迫下花生生理特性变化以及盐胁迫对花生品质影响等方面[25-26]，但是对花生耐盐分子遗传机理的研究鲜见报道。本研究利用花育28号和P76构建的RIL群体，对2013，2014年2个年份盐胁迫下的表型进行调查，基于构建的高密度遗传连锁图谱，开展花生盐胁迫下相关性状的QTL分析，对花生耐盐基因的挖掘具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以花育28号和P76为亲本构建的RIL群体为试材。花育28号由山东省花生研究所育成，通过了山东省农作物品种审定委员会审定；P76为来源于山东省花生研究所的高油酸品系，RIL群体包含146个株系。2013年(F2∶9)和2014年(F2∶10)材料种植于山东省花生研究所试验站，2013，2014年收获后晾干备用。

1.2 试验方法

1.2.1 幼苗期耐盐性鉴定 选取亲本和RIL群体各株系饱满种子40粒于双层滤纸的培养皿中，置于黑暗条件下人工培养箱(28～30 ℃)中进行培养，3 d后选择芽长约2 cm生长状况良好且相对一致的花生种子移栽至2组装满纯水的花生种子发芽盒A、B中，放置在人工气候室内，在29 ℃条件下培养至幼苗长成“两叶一心”后对A、B这2组进行处理，种子发芽盒中溶液的盐浓度分别为0，0.75%，之后每2 d换一次盐溶液和纯水，处理7～9 d后从A、B 2组中各挑选不同株系的长势大致相同的花生幼苗3株为样本进行测量，测定各株高、主根长、茎叶干质量、根干质量、茎叶鲜质量、根鲜质量；重复3次。

花生耐盐性指标：耐盐指数=盐处理值/对照值。将各指标转化为相对值；利用Excel对各耐盐碱指标进行分析。

1.2.2 图谱构建和QTL分析 利用RIL群体构建了包含2 334个标记的高密度遗传图谱，该图谱包含68个SSR标记和2 266个SLAF标记，覆盖全基因组图距为2 586.37 cM，分布于20个连锁群，标记间的平均距离为2.25 cM。应用完备区间作图软件IciMapping v3.0(http：//www. isbreeding.net/)[27]对表型值进行QTL分析。LOD阈值经1 000次模拟计算后得到，其中将 LOD 值低于 2.5 的 QTL 忽略，以增加 QTL 检测的准确性与可靠性。

QTL 命名方法按照 QTL+性状+群体名称+染色体+QTL 数。其中，QTL 以 q 表示，性状和群体以英文缩写表示，染色体以花生染色体表示，染色体上 QTL 数目以数字表示，性状与群体名称间加“-”，群体名称和染色体间加“-”，染色体和 QTL 数间加“.”。如qSmsh-HP-A10.1表示A10 染色体上盐胁迫株高(SMSH)的 QTL，HP为花育28号×P76构建的 RIL 群体的缩写，1 表示该染色体上的第一个盐胁迫株高的 QTL。

2 结果与分析

2.1 幼苗期耐盐性相关性状的表型变异

在0.75%盐浓度条件培育下，花育28号和P76各测定指标的绝对值和相对值表现有一定差异(表1)。盐胁迫下花育28号株高、主根长(2013年除外)、茎叶干质量、根干质量、茎叶鲜质量、根鲜质量的相对值均高于P76。各指标的偏度和峰度绝对值表现有差异，盐胁迫下根干质量(2014年)绝对值的峰度为3.72，其他指标的峰度绝对值均小于1或接近1；盐胁迫下根系相关指标相对值的峰度偏高，而地上指标相对值的峰度较低；这些性状表现为连续变异，每个性状都表现超亲分离，且多数性状频数分布基本符合正态分布；表明为多基因控制的数量性状，适合进行 QTL 定位分析。

2.2 幼苗期耐盐性相关性状 QTL 分析

表1 RIL 群体及其亲本的盐胁迫相关性状在不同环境下的表现Tab.1 Evaluation of traits related to salt stress of the RIL populations and their parents in different environments

利用IciMapping对盐胁迫下各表型绝对值进行分析，获得13个相关的QTL，分布于10个连锁群上。其中，株高相关的QTL 3个：qSmsh-HP-A10.1、qSmsh-HP-B02.1和qSmsh-HP-B05.1分别位于A10、B02和B05染色体，解释的表型变异分别是4.13%，4.79%和6.69%，加性效应分别为0.36，0.40和-0.44，其中qSmsh-HP-A10.1、qSmsh-HP-B02.1的增效等位基因来源于花育28号，qSmsh-HP-B05.1的增效等位基因来源于P76。主根长相关的QTL 2个：qSrl-HP-A03.1和qSrl-HP-A06.1分别位于A03、A06染色体，解释的表型变异分别是5.63%，4.17%，加性效应分别为0.32，0.21，二者的增效等位基因来源于花育28号。茎叶干质量相关的QTL 2个：qSwdp-HP-A08.1和qSwdp-HP-A07.1分别位于A08、A07染色体，解释的表型变异分别是4.99%，3.08%，二者的增效等位基因来源于花育28号。茎叶鲜质量相关的QTL 4个：qSwfp-HP-A04.1、qSwfp-HP-B02.1、qSwfp-HP-B03.1、qSwfp-HP-B07.1分别位于A04、B02、B03和B07染色体，解释的表型变异分别是6.13%，5.73%，6.88%和5.30%，qSwfp-HP-A04.1的增效等位基因来源于P76，qSwfp-HP-B02.1、qSwfp-HP-B03.1、qSwfp-HP-B07.1的增效等位基因来源于花育28号。根鲜质量相关的QTL个：qSwfr-HP-B03.1、qSwfr-HP-B03.2均位于B03染色体，解释的表型变异分别是2.81%，3.12%，二者的增效等位基因来源于花育28号。

对盐胁迫下各指标相对值进行分析表明，检测到株高相对值相关的QTL 3个：qRmsh-HP-A06.1、qRmsh-HP-B02.1和qRmsh-HP-B04.1分别位于A06、B02和B04染色体，解释的表型变异分别是3.01%，2.80%和3.47%，其增效等位基因均来源于花育28号。检测到主根长相对值相关的QTL 2个：qRrl-HP-A08.1、qRrl-HP-B06.1分别位于A08、B06染色体，解释的表型变异分别是16.72%，22.42%，其增效等位基因来源于P76。检测到茎叶鲜质量相对值相关的QTL 1个：qRwfp-HP-B02.1位于B02染色体，解释的表型变异分别是5.43%，其增效等位基因来源于花育28号。

对比发现，在B02染色体上检测到4个QTL(表2、图1)，分别为qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRmsh-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1，其控制盐胁迫下绝对株高、相对株高、绝对茎叶鲜质量和相对茎叶鲜质量，qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1两端的标记为Ah1TC1B02和Marker774175，qRmsh-HP-B02.1两端的标记为Marker774175和Marker911824，4个QTL的增效等位基因均来源于花育28号。

表2 盐胁迫相关性状的 QTL 检测结果Tab.2 QTLs for traits related to salt stress

图1 盐胁迫下绝对株高、相对株高、绝对茎叶鲜质量和相对茎叶鲜质量相关QTL在全基因组上的分布Fig.1 QTL overviews of absolute and relative value of main stem height and shoot fresh weight on salt stress

3 讨论与结论

花生生长的各个时期耐盐性表现不同。吴兰荣等[23]对花生全生育期进行耐盐性鉴定，表明花生芽期和幼苗期是对盐害最敏感时期，花生芽期耐盐性与后期耐盐性无明显相关。因此，本试验将幼苗期作为花生耐盐性重要时期进行QTL定位。根据前期大量不同盐浓度处理结果，选用0.75%盐浓度作为水培条件下花生耐盐性鉴定浓度。对于花生耐盐性鉴定指标，慈敦伟等[22]采用盆栽试验，开展花生苗期耐盐性评价及耐盐指标筛选，认为地上部形态和生物量可作为耐盐评价的首选指标，而主根长和出苗速度可作为辅助指标用以判断花生品种的综合耐盐能力。本研究选用盐胁迫下主茎高、茎叶鲜质量、茎叶干质量、主根长、根鲜质量、根干质量作为调查指标研究花生的耐盐性。

花生耐盐性分子生物学的研究集中于转外源基因对于花生耐盐性影响和花生耐盐相关基因的克隆。王亚等[28]通过花粉管通道法，将携带条斑紫菜PyTPS基因的pCAMBIA2300-PyTPS重组载体导入花生；宗自卫等[29]将甜茶碱BADH基因转入花生；表明转基因植株比对照植株耐盐性有所提高。王宝枝[30]克隆出了花生中的2种耐盐基因液泡膜 Na+/H+逆转运蛋白NHX1 基因和多胺生物合成中的一个关键的调节酶SAMDC基因；Chen等[31]通过序列分析及同源性比对方法从花生已有cDNA文库中筛选到6个AP2/ERF家族转录因子基因，并获得其全长，转基因拟南芥表明，AhERF6转入拟南芥中能够增强转基因植株盐胁迫下盐胁迫相关关键基因的表达。而目前关于花生耐盐性QTL的研究尚未见报道。本研究检测到13个盐胁迫下各指标绝对值相关的QTL，分布于10个连锁群上；检测到6个盐胁迫下各指标相对值相关的QTL。在B02染色体上检测到1个QTL热点区，包含4个QTL：qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRmsh-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1，控制盐胁迫下株高和茎叶鲜质量，其贡献率分别4.79%，5.73%，2.80%和5.43%，增效等位基因均来源于花育28号，qRmsh-HP-B02.1两端标记为Marker774175和Marker911824，其他3个QTL两端标记为Ah1TC1B02和Marker774175。这种热点区对于深入研究花生耐盐机制具有重要意义。

本研究基于RIL群体表型数据和高密度遗传图谱，检测到19个盐胁迫下相关的QTL。检测到1个QTL热点区，位于B02染色体，包含4个QTL：qSmsh-HP-B02.1、qSwfp-HP-B02.1、qRmsh-HP-B02.1、qRwfp-HP-B02.1，盐胁迫下株高和茎叶鲜质量，增效等位基因均来源于花育28号。这种热点区对于深入研究花生耐盐机制具有重要意义。

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