陆地棉油菜素内酯信号基因GhBES1家族的鉴定及表达分析

束红梅，郭书巧，巩元勇，蒋 璐，朱静雯，倪万潮

(江苏省农业科学院 经济作物研究所，农业部长江下游棉花与油菜重点实验室，江苏 南京 210014)

陆地棉油菜素内酯信号基因GhBES1家族的鉴定及表达分析

束红梅，郭书巧，巩元勇，蒋 璐，朱静雯，倪万潮

(江苏省农业科学院 经济作物研究所，农业部长江下游棉花与油菜重点实验室，江苏 南京 210014)

BES1基因是植物激素油菜素内酯信号转导过程中的重要转录因子，为了解陆地棉油菜素内酯信号基因GhBESI家族 ,通过对陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库的全面分析和鉴定，获得21个GhBES1基因，这些基因分布在不同的亚基因组，有9对基因在A亚组和D亚组上存在对应关系，AD亚组对应基因序列一致性高于95%。根据进化分析，21个GhBES1基因分为4个亚家族，除了亚家族Ⅲ，其他3个亚家族在拟南芥中均有对应基因；除了亚家族Ⅳ基因和亚家族Ⅱ中GhBES1-1基因外，其他GhBES1基因均有2个外显子。亚细胞定位结果表明，21个GhBES1蛋白主要定位到细胞核、细胞质等部位，其中7对基因的蛋白亚细胞定位完全一致。GhBES1基因在根、茎、叶、顶端分生组织中均有表达，但不同亚家族基因在不同组织中的表达水平存在差异。研究结果为棉花GhBES1基因家族功能的深入研究奠定了基础。

陆地棉；GhBES1基因家族；系统进化分析；基因表达

油菜素内酯(Brassinosteroid，BR)是植物正常生长发育所必需的重要植物激素，同时也参与了植物的逆境响应[1-3]。近年来，关于油菜素内酯信号转导研究已取得了突破性的进展[4-5]，在模式植物拟南芥中已经明确油菜素内酯信号通路[6-9]。油菜素内酯从受体BRI1传递信号给核靶基因依赖于BES1(BRI1 EMS SUPPRESSOR 1)家族的转录因子。

BES1是在功能增强型突变体BES1-D中发现的[10-11]，油菜素内酯信号的传递最终使去磷酸化状态的BES1/BZR1在细胞内累积，激活油菜素内酯信号通路下游的转录调控[10]。在植物转录因子数据库中近80个物种存在BES1转录因子家族，但是每个物种BES1家族的基因数目存在差异，在模式植物拟南芥中BES1转录因子家族有8个成员[11-13]。研究人员通过ChIP-chip鉴定了BES1转录因子的靶基因，Yu等[14]鉴定的1 609个BES1靶基因中至少有250个是受油菜素内酯调控的，这些基因参与调控生长发育、细胞信号转导、环境胁迫响应以及与其他激素信号通路间的交互等过程。而且，元件序列分析证明BES1有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)DNA结合结构域可以绑定到E-盒(CANNTG)或BRRE(BR response element，CGTGT/CG)以调节靶基因的表达[15-16]，而BRRE和E-盒在油菜素内酯诱导或抑制基因的启动子中都存在。因此，BES1转录因子在油菜素内酯调控植物生长发育和逆境响应过程中起着重要作用。

陆地棉(Gossypiumhirsutum)是当今最重要的棉花栽培品种。二倍体D亚组雷蒙德氏棉和A亚组亚洲棉测序工作的完成[17-18]，以及陆地棉遗传标准系TM-1全基因组序列的公布[19-20]，为棉花分子生物学研究奠定了良好的基础。然而，目前在基因组水平上关于棉花BES1基因家族的研究较少。因此，本研究利用生物信息学方法，分析鉴定陆地棉全基因组序列中的BES1家族基因，从基因组水平上分析BES1基因在陆地棉中的数目、序列特征、进化与组织表达特征，为进一步研究BES1家族成员的生物学功能奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据来自南京农业大学作物遗传与种质作物创新重点实验室(http：//mascotton.njau.edu.cn/html/Data/Genomefhsequence/2015/05/05/16ab0945-19e9-49f7-a09e-8e956866bf.html)。

1.2GhBES1家族成员鉴定及序列分析

用HMMER及Blast程序搜索鉴定陆地棉全基因组中GhBES1家族的所有成员。用Perl程序从基因组数据库文件Gossypium_hirsutum_v1.1.cds.fa和Gossypium_hirsutum_v1.1.pep.fa中提取GhBES1基因的CDS序列和氨基酸序列。

利用ProtParam工具(http：//web.expasy.org/protparam/)在线分析获得陆地棉GhBES1蛋白氨基酸序列的分子量、等电点等信息。

1.3BES1基因的进化和结构分析

用GSDS(Gene structure display server，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)绘制BES1基因结构图。

用DNAMAN软件，对陆地棉BES1基因家族成员进行序列同源性的比对，在氨基酸水平上分析他们的遗传多样性；使用ClustalX(1.83)软件对氨基酸序列进行多序列联配，将多序列联配的结果通过Mega 5.0软件进行分析，构建了系统进化树，采用邻近法(Neighbor-joining，NJ)并利用Bootstrap方法进行评估，数值设置为1 000。

1.4 亚细胞定位预测

利用WoLF PSORT软件(http：//www.genscript.com/wolf-psort.html)分析氨基酸序列，进行亚细胞定位预测。

1.5GhBES1基因家族成员的表达分析

用OMIGA公司植物RNA提取试剂盒提取陆地棉根、茎、叶、顶端分生组织的总RNA。以梯度总RNA量及梯度循环数确定可区分表达强度差异的最佳PCR循环数。以等量总RNA进行RT-PCR，所用引物见表1，扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离。反转录所用生化酶等购自Promega公司，PCR所用酶等购自TaKaRa公司，RNA提取过程中所需枪头、离心管等购自Axygen公司。

表1 引物Tab.1 PCR primers

2 结果与分析

2.1 陆地棉GhBES1基因家族鉴定及序列分析

根据已公布的BES1基因的结构域DUF822，从陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据中共鉴定出21个GhBES1基因，根据这些基因在染色体出现的先后顺序分别命名为GhBES1-1～GhBES1-21 (表1)。对鉴定出来的基因进行分析，在A亚组共有10个GhBES1基因，在D亚组共有11个GhBES1基因，其中A亚组中9个基因在D亚组有对应基因。并且在A05和D05、A11和D11这2对亚基因组中有2对GhBES1基因，其他成对的亚基因组只有1对平行同源进化基因(表2、图1)。基因序列一致性分析发现(图1)，A、D亚组相对应的9对基因的序列一致性高于95%。但其他GhBES1基因序列的一致性差异较大，有些基因的序列一致性只有38%。

表2 陆地棉GhBES1基因家族基本信息Tab.2 Basic information of GhBES1 gene family of upland cotton

这21个GhBES1基因的编码区和CDS最长的是GhBES1-19，最短的是GhBES1-13。除了GhBES1-3和GhBES1-13、GhBES1-9和GhBES1-19这2对基因外，其余8对基因的CDS序列长度完全一致。蛋白质理化性质分析表明，21个GhBES1蛋白的氨基酸序列个数从176(GhBES1-13)～737(GhBES1-19) 不等，其中有15个蛋白的氨基酸序列集中在320个氨基酸左右；分子量最大的是83.036 kDa (GhBES1-19)，最小的是19.740 kDa(GhBES1-13)；理论等电点最大的是9.26(GhBES1-13)，最小的是5.39(GhBES1-17)(表2)。

2.2 陆地棉GhBES1家族基因结构及系统进化分析

基于陆地棉GhBES1基因的蛋白全长序列构建了系统进化树(图2)。对陆地棉中21个GhBES1基因和拟南芥中8个AtBES1基因进行遗传多样性分析，结果表明：BES1基因家族成员之间同源性变异幅度较大。按照进化情况陆地棉中21个GhBES1基因分为4个亚家族，除了亚家族Ⅲ外，每个陆地棉GhBES1亚家族在拟南芥中均有对应基因。亚家族Ⅰ中有6个GhBES1基因，对应拟南芥中的AtBES1、AtBZR1、AtBEH1、AtBEH2；亚家族Ⅱ中有8个GhBES1基因，对应拟南芥中的AtBEH3、AtBEH4；亚家族Ⅳ中有5个GhBES1基因，对应拟南芥中的AtBMY2、AtBMY7。

对陆地棉GhBES1家族成员的基因结构分析表明(图2)，GhBES1基因家族大多数成员的结构比较简单，其中亚家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中基因除GhBES1-1外均含有2个外显子，亚家族Ⅳ的5个GhBES1基因含有5～12个外显子。从基因的外显子长度(图2、表3)看出：在10对基因中，有7对A、D亚基因组对应的基因外显子个数及片段大小完全一致。GhBES1-1和GhBES1-11外显子个数相差1个，但长度相同；GhBES1-3和GhBES1-13外显子个数相同，但长度存在差异；GhBES1-9和GhBES1-19的差异较大，分别含有5，12个外显子，后者的外显子序列长度明显长于前者，而且后者的内含子序列长度达到6 842 bp。

图1 GhBES1基因序列的一致性分析Fig.1 Analysis of sequence identities among GhBES1 genes

2.3 陆地棉GhBES1蛋白的亚细胞定位

陆地棉TM-1基因组中21个GhBES1蛋白成员的亚细胞定位预测结果表明(表2)，亚家族Ⅱ中8个GhBES1蛋白均只有1个亚细胞定位，定位到细胞核；亚家族Ⅰ中的6个蛋白和GhBES1-3、GhBES1-7、GhBES1-17共9个成员具有2个亚细胞定位，定位到细胞核、线粒体或细胞质；亚家族Ⅳ中GhBES1-9、GhBES1-19、GhBES1-21和亚家族Ⅲ中GhBES1-13 4个成员具有3个或3个以上亚细胞定位，定位到细胞核、叶绿体、细胞质等。9对A、D亚组对应基因中，有7对基因具有相同的亚细胞定位。

2.4 陆地棉GhBES1基因的组织表达分析

从陆地棉GhBES1基因的4个亚家族选择代表基因(表3中加粗的基因)进行组织表达分析(图3)。所选的5个代表基因在根、茎、叶、顶端分生组织中均有表达，其中GhBES1-1(亚家族Ⅱ)在根中表达量较高，GhBES1-2(亚家族Ⅰ)在叶中的表达量略低，GhBES1-3(亚家族Ⅲ)在根中的表达量较低，GhBES1-7和GhBES1-21同属于亚家族Ⅳ，两者在各个组织中的表达水平差异不明显。可以看出不同亚家族GhBES1基因在各个器官中的表达有差异，推测这些GhBES1基因在各个器官中的功能可能也存在差异。

图2 BES1基因家族的系统进化树和基因结构Fig.2 The phylogenetic tree and gene structure of BES1 genes

表3 陆地棉21个GhBES1基因外显子的比较Tab.3 Comparison of exon of 21 GhBES1 genes of cotton bp

D.顶端分生组织；Y.叶片；J.茎；G.根。D.Apical meristem.Y.Leaf;J.Stem;G.Root.

3 讨论

BES1基因是油菜素内酯信号转导过程中的重要基因[14-16]，但关于其在陆地棉中的情况研究较少。本研究在陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据中发现有21条GhBES1基因的家族成员，其中9对为A亚组和D亚组对应基因，这与前人相关研究认为二倍体A 组亚洲棉和D组雷蒙德氏棉基因组之间存在很强的共线性的结论相吻合[20-21]；9对共线性基因中，7对共线性基因的氨基酸长度、结构完全相同，并且这7对基因具有完全相同的亚细胞定位。但是除了共线性基因，其他GhBES1基因的序列相似度较低。说明陆地棉21个GhBES1基因中有共线性基因的存在，但也有部分基因序列差异明显。

拟南芥BES1基因家族有8个成员，其中部分成员的功能都已研究得较为清楚[7，11，22-24]。对陆地棉和拟南芥中的所有BES1进行进化树分析发现，在陆地棉标准系TM-1基因组中鉴定的21个GhBES1基因家族成员分为4个亚家族，除了亚家族Ⅲ，其余每个亚家族在拟南芥中有同源基因，由此推测，棉花和拟南芥BES1基因家族成员在功能上可能具有一定的相似性。因此，在研究棉花GhBES1基因家族成员功能时，在一定程度上可以参考拟南芥中BES1基因的研究结果。

组织表达分析表明，TM-1全基因组中的GhBES1基因家族的代表基因在根、茎、叶和顶端分生组织中均有表达，这在一定程度上暗示棉花GhBES1基因家族多数成员可能在多个组织的生长发育过程中起作用，但是不同亚家族的GhBES1基因在不同组织中的表达存在差异，说明这些BES1基因的功能可能也存在差别。

前人研究表明，油菜素内酯信号基因BES1通过介导调控下游基因的表达进而调控植物的生长发育和逆境响应[7，11，22-24]。在本研究中陆地棉21个GhBES1基因中部分基因的序列结构、组织表达存在差异，那么它们在植物生长发育、逆境响应中哪些途径起作用、功能存在哪些差异，还有待深入研究。

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Identification and Expression Analysis of the Brassinosteroid Signal GeneGhBES1 Family in Upland Cotton

SHU Hongmei，GUO Shuqiao，GONG Yuanyong，JIANG Lu，ZHU Jingwen，NI Wanchao

(Institute of Industrial Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Cotton and Rapeseed (Nanjing)，Ministry of Agriculture，Nanjing 210014，China)

BES1 gene is a major transcription factor responsible for brassinosteroid-regulated gene expression and plant growth.In order to know the family ofGhBES1 gene in upland cotton,21GhBES1 genes were identified from the genome sequence database of upland cotton (GossypiumhirsutumL.acc.TM-1).TheseGhBES1 genes were found to be distributed on different subgenomes.There were 9 pairs ofGhBES1 genes in the A and D subgenomes with one-to-one correspondence relationship，and the gene sequence identity of the correspondence genes were higher than 95%.Based on the results of phylogenetic tree，the 21GhBES1 genes could be divided into four subfamilies，and there were homologous genes ofArabidopsisthalianaL.in each subfamily，except for subfamily Ⅲ；GhBES1 genes had two exons, except for genes in subfamily Ⅳ andGhBES1-1 in subfamily Ⅱ.The result of subcellular localization indicated that 21 GhBES1 proteins were primarily located in nuclear and cytoplasmic，and 7 pairs ofGhBES1 genes had the same location.The tissue expression analysis showed thatGhBES1 genes were expressed in the leaf，root，stem and shoot apical meristem，but the expression level ofGhBES1 genes in different subfamily were different.These results provide a theoretical basis on cloning and functional research ofGhBES1 genes.

Upland cotton；GhBES1 gene family； Phylogenetic analysis；Gene expression

2017-04-16

国家自然科学基金项目(31201139)；国家转基因生物新品种培育项目(2016ZX08005-001)

束红梅(1982-)，女，江苏射阳人，副研究员，博士，主要从事农业生物技术研究。

倪万潮(1962-)，男，江苏盱眙人，研究员，硕士，主要从事农业生物技术研究。

S562；Q78

A

1000-7091(2017)04-0007-06

10.7668/hbnxb.2017.04.002