牡丹PsSPL3基因的克隆和表达特性分析

战新梅，管世铭，张玉喜

(青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109)

牡丹PsSPL3基因的克隆和表达特性分析

战新梅，管世铭，张玉喜

(青岛农业大学 生命科学学院，山东省高校植物生物技术重点实验室，山东 青岛 266109)

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)转录因子在植物多个生理过程中发挥重要的生理功能，为了研究其在牡丹花芽休眠进程中的作用机理，采用RACE方法，从牡丹花芽中克隆得到了一个SPL基因。该基因全长cDNA 1 057 bp，完整开放阅读框为549 bp，编码182个氨基酸，Blast分析表明，编码的氨基酸序列中具有SBP-box基因家族所特有的SBP-box保守结构域。与拟南芥已知SPLs蛋白构建进化树结果表明，牡丹SPL蛋白与AtSPL3聚为一支，该基因被命名为PsSPL3。生物软件预测PsSPL3蛋白分子量为20.349 4 kDa，理论等电点为9.62。同源性分析了牡丹PsSPL3与其他已知植物的SPL3，相似性为47.98%～69.46%，其中与白桦的SPL3蛋白相似性最高，为69.46%。实时定量PCR分析PsSPL3基因在初花期牡丹不同组织中和花芽休眠过程中的表达水平，结果表明，PsSPL3基因在不同组织中表达差异较大，其中在根中转录水平最高，在茎和花瓣中次之；PsSPL3基因在休眠进程中的转录水平呈先上升后下降趋势，其中低温处理14 d时，PsSPL3基因的表达量达到最高。低温7 d结合外源施加GA3的牡丹花芽中PsSPL3基因的表达量显著增加，推测PsSPL3基因的转录受GA3诱导来促进牡丹花芽内休眠解除的进程。

牡丹；PsSPL3；RACE；实时定量PCR；表达模式

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是绿色植物中非常特殊的一类转录因子，最早由Huijser等[1]从金鱼草(Antirrhinummajus)的花序cDNA文库中筛选到，在SPL蛋白质的一级结构中，存在着一个大约由80个氨基酸残基构成的保守结构域，称为SBP结构域。Cardon等[2]在拟南芥中克隆了许多个能够编码SBP蛋白的相关基因，其中拟南芥SPL3基因与金鱼草的SBP1基因有非常高的同源性特征，这些SPL基因均可以与APETALA1(AP1) 基因的启动子区域通过SBP结构域发生特异性的相互结合。SPL基因家族成员广泛存在于许多植物中，如玉米[3]、水稻[4]、番茄[5]、草莓[6]、陆地棉[7]、葡萄[8-9]、枳[10]、桦树[11-12]等。SPL转录因子在调控植物胚胎发育、叶片发育[13]、发育阶段转变、花和果实发育[13-14]、育性、顶端优势、花青素积累、赤霉素响应[15]、光信号转导及体内铜离子稳态平衡等方面均发挥重要作用[16]。SPL基因主要通过调控花分生组织特征基因LEAFY(LFY)影响花序的形态建成[17]。

青岛农业大学牡丹生物学课题组在牡丹(Paeoniasuffruticosa)休眠方面，做了大量的研究工作[18-22]。Gai等[20]研究了与牡丹休眠解除有关的转录因子，筛选到了包括类SPL基因片段的176个转录因子[21]。本试验研究了牡丹中的SPL家族成员，通过RACE扩增得到了PsSPL3基因的全长cDNA，研究了PsSPL3基因在牡丹不同组织的表达模式，及休眠进程中牡丹花芽中PsSPL3基因的表达模式，以期为进一步解析SBP-box基因家族在牡丹休眠中的功能提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与处理

供试材料为牡丹品种鲁菏红(由青岛农业大学植物生理研究室提供)。第1组处理：取4月初处于初花期的牡丹根、茎、叶、萼片、花瓣和雄蕊共6种组织材料，液氮冷冻后-80 ℃保存备用。第2组处理：11月中下旬，此时日最低气温可达10 ℃，此时处理定为0 d，作为对照，此后选取一定数量的植株转移冷库中(4 ℃)，之后每隔7 d将其转入温室(25 ℃)并取样，一共5个低温处理时间(0，7，14，21，28 d)，剥去鳞片后，液氮速冻，-80 ℃条件下保存备用。第3组处理：低温处理7 d移入温室后外施500 mg/L GA3处理，20%乙醇作为对照。分别于处理后0，1，3，5 d后，随机选取顶芽若干个，处理同上。

1.2 总RNA提取与cDNA合成

总RNA提取与cDNA合成参照张璐等[18]方法进行。

1.3 RACE扩增和实时定量PCR

RACE扩增按照张璐等[18]方法进行(引物序列见表1)。实时定量25 μL的 PCR反应体系根据SYBR®Premix DimerEraserTM(TaKaRa)试剂盒配制[19]，牡丹ACTIN基因为内参，数据分析采用2-ΔΔCt法[23]。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of the specific primers used in this study

1.4 生物信息学分析

用DNAMAN软件进行序列拼接，ORF finder和Interproscan等工具分别预测功能域和编码框，用ProtParam程序进行等电点和蛋白质分子量等性质的预测。利用NCBI数据库中Blast和ClustalW进行同源性分析，利用MEGA 6.0软件构建系统进化树(Bootstrap=1 000)。

2 结果与分析

2.1PsSPL3基因全长cDNA序列和氨基酸序列的获得

由于已知EST的5′端编码区完整，因此只需设计引物扩增3′端。经3′RACE PCR扩增，3′ RACE PCR产物大约370 bp(图1)。SPL基因cDNA全长1 057 bp(图2)，5′非编码区(UTR)长度为135 bp，3′ UTR为373 bp。549 bp的完整的开放阅读框编码182个氨基酸(GenBank accession No.KP314264)，其预测的PsSPL3蛋白分子式为C860H1430N280O261S15，其分子量为20.349 4 kDa，理论等电点pI为9.62。在NCBI上分析保守结构域，其具有SBP-Box保守结构域，即第58～136个氨基酸，该结果符合典型的SBP-box基因家族的结构特征，说明该基因属于其中一员。利用ClustalW软件将编码蛋白与拟南芥的SPL氨基酸序列进行同源比对(图3)，其与AtSPL3聚为一组，推测牡丹SPL蛋白和拟南芥AtSPL3在结构和功能上可能有着一定的相似性，该基因被命名为PsSPL3。

M.DL2000 Marker；1.PsSPL3基因的3′-RACE PCR产物。M.DL2000 Marker；1.3′-RACE PCR product.

斜体并加粗表示起始密码子ATG和终止密码子TAA；波浪线表示polyA尾；阴影部分为SBP结构域；方框部分为锌指结构域；单下划线部分为核定位信号。Initiation codon is ATG and terminate codon is TAA，italic and bold； polyA tail is marked with wavy line；Conservative regions is shaded area;Part of the box for structure is zinc finger domains;Nuclear localizationsignal is marked by single under line.

图3 牡丹PsSPL3与拟南芥AtSPLs的系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree of PsSPL3 and AtSPLs of Arabidopsis thaliana

2.2 PsSPL3蛋白序列的同源性分析与进化树的构建

利用在线软件ClustalW分析PsSPL3与其他已知植物的SPL3氨基酸序列的同源性(图4)，结果表明，PsSPL3与其他已知植物的SPL3相似性为47.98%～69.46%，其中最高的是与白桦的SPL3蛋白相似性，为69.46%，与杨树的相似性次之，为65.71%，与烟草的SPL3蛋白最低，为47.98%。利用MEGA 6.0软件构建系统进化树(图4)，PsSPL3与白桦SPL3先聚到一个分支，再与杨树和可可等木本植物形成分支，最后与烟草聚到一起，结果符合进化关系，与同源性比对结果一致。

图4 牡丹PsSPL3与其他物种SPL3蛋白的系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree of PsSPL3 and the known SPL3 proteins in the other plants species

2.3 牡丹PsSPL3基因的表达模式分析

利用实时定量PCR分析PsSPL3基因在牡丹初花期不同组织中的表达水平，结果表明，PsSPL3基因在牡丹的不同组织中呈现差异表达，其中在根中表达水平最高，在茎和花瓣中次之，在雄蕊和萼片中表达水平最低(图5)。

图5 PsSPL3在牡丹初花期不同组织中的表达模式Fig.5 The relative expression level of PsSPL3 in different tissues at the early flowering stage of tree peony

分别采用人工低温0，7，14，21，28 d处理牡丹，利用实时定量PCR检测PsSPL3基因在人工4 ℃低温解除牡丹花芽休眠过程中的表达特性(图6)。结果显示，PsSPL3基因的表达量在休眠进程中呈先上升后下降趋势，其中低温处理14 d时，PsSPL3基因的表达量达到最高；低温处理21 d时，PsSPL3基因的表达量虽有下降但仍然维持在比较高的水平；低温28 d时，此时牡丹花芽进入了生态休眠阶段[20]，PsSPL3基因的表达量迅速下降。

图6 PsSPL3在低温处理不同时间的牡丹花芽中的表达模式Fig.6 The relative expression level of PsSPL3 in tree peony bud after different chilling treatments

在低温处理7 d后移入温室，外施GA30，1，3，5 d后取材，利用实时定量PCR检测PsSPL3基因的表达水平(图7)。结果表明，PsSPL3基因在外施GA3的牡丹花芽中的表达量要显著高于对照，推测PsSPL3基因的表达受GA3诱导来促进牡丹花芽内休眠解除的进程。

*.P<0.05。

3 讨论

本研究通过RACE技术扩增得到了PsSPL3基因1 057 bp的全长cDNA序列，Blast分析证明它具有SBP-box基因家族所特有的SBP-box保守结构域。该域含有保守的半胱氨酸和组氨酸组成的2个锌指蛋白域及一段核定位信号。SBP蛋白可以通过该信号肽序列引导进入细胞核，从而调控下游相关基因的转录，这是SBP基因家族的典型特征[24]。

SPL基因在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用，它会影响植物的早期胚胎发育过程[25]、叶片发育[13]、花器官的发育[2]、果实发育和成熟[13-14]。笔者研究了牡丹PsSPL3基因在不同器官的时空表达特征，PsSPL3在营养器官和花器官中均有表达，其中在根中表达水平最高，在茎和花瓣中次之，可推测PsSPL3参与牡丹营养器官与花器官的发育。而朱富勇[26]发现紫牡丹中PdSPL9在芽中表达量最高，认为PdSPL9可能调控紫牡丹幼年期向成年期的转变。GhSPL3在棉花的花中表达量最高[7]，而宋长年等[10]却发现Pt-SPL9和Pt-SPL13对枳的茎和果实的发育起着重要作用。葡萄VvSPL9 和VvSPL10可能参与葡萄营养器官与生殖器官的发育，尤其与葡萄果实的生长发育关系密切[9]。21 d的(4 ℃)低温积累量是解除牡丹花芽休眠所必需的[20]。荧光实时定量PCR结果显示，当低温积累14 d时，PsSPL的表达量达到最大值，当低温21 d及以后，牡丹花芽内休眠得以完全地解除并进入了生态休眠阶段，其表达量减少，说明低温诱导了PsSPL3基因的转录进而促进了牡丹花芽内休眠的解除。张文娟等[27]认为赤霉素可以部分的代替低温来解除牡丹花芽的休眠，SPL可能与生长素、赤霉素和乙烯等多种激素的信号转导途径有关[15]。本研究中，PsSPL3在低温7 d后外施GA3处理的牡丹花芽中的表达结果表明，PsSPL3基因对赤霉素有响应，低温结合外施赤霉素可以解除花芽内休眠，进一步说明PsSPL3基因在牡丹花芽内休眠解除过程中起着很重要的作用。

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Cloning and Expression Pattern Analysis ofPsSPL3 in Tree Peony

ZHAN Xinmei，GUAN Shiming，ZHANG Yuxi

(College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Qingdao 266109，China)

Transcription factor of SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like) plays very important role among many physiological processes of plants.In order to study the mechanism of action，a 1 057 bp full-length cDNA ofPsSPL3 gene was isolated fromPaeoniasuffruticosausing RACE method.Bioinformatic analysis showed that the ORF length ofPsSPL3 was 549 bp which encodes 182 amino acid residues with relative molecular mass of 20.349 4 kDa and the isoelectric point of 9.62.Blast analysis showed that PsSPL3 contained a typical SBP-box structure domain.Evolutionary tree analysis revealed that the putative SPL protein of tree peony and AtSPL3 were clustered in same group，so theSPLgene of tree peony was namedPsSPL3.The homology of amino acid compared with PsSPL3 and other known SPL3 was 47.98%-69.46%，and the homology with BpSPL3 was highest with 69.46%.The expression pattern ofPsSPL3 in different tissues at the early stage of flowering was analyzed by quantitative Real-time PCR(qPCR)，and the results showed that the transcript ofPsSPL3 in the root was the highest，and the lower were in stem and petal.The expression pattern ofPsSPL3 during dormancy release of tree pony showed that the expression ofPsSPL3 gene was first increased and then decreased.When the tree peony flower bud were exposed 14 d chilling，the expression level ofPsSPL3 gene was the highest.The expression ofPsSPL3 gene in the flower buds after 7 d chilling with exogenous application of GA3was significantly higher than that in the control，suggested that the expression ofPsSPL3 gene was induced by GA3to promote the process of dormancy release in tree peony flower bud.

Paeoniasuffruticosa；PsSPL3； RACE； Real-time PCR； Expression pattern

2017-04-23

国家自然科学基金面上项目(31471908； 31372104；31672194)

战新梅(1976-)，女，山东莱阳人，讲师，博士，主要从事牡丹分子生物学研究。

张玉喜(1977-)，女，山东聊城人，副教授，博士，主要从事牡丹分子生物学研究。

Q78；S685.03

A

1000-7091(2017)04-0013-06

10.7668/hbnxb.2017.04.003