转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

张安红，王志安，肖娟丽，罗晓丽

(1.山西省农业科学院 棉花研究所，山西 运城 044000；2. 棉花种质资源利用与分子设计育种山西省重点实验室，山西 运城 044000)

转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

张安红1,2，王志安1，肖娟丽1，罗晓丽1,2

(1.山西省农业科学院 棉花研究所，山西 运城 044000；2. 棉花种质资源利用与分子设计育种山西省重点实验室，山西 运城 044000)

AREB/ABFs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应。为了获得具有较高耐盐水平的棉花新种质材料，通过农杆菌介导法将耐盐转录因子基因(GHABF4 )导入陆地棉中棉35中，通过对转化植株的卡那霉素初步筛选及T1、T2、T3目的基因 PCR的分子检测，获得T3转基因棉花纯合系。通过盐胁迫试验对5个T3转基因棉花株系和非转基因棉花对照进行耐盐性分析。结果表明，在200 mmol/L NaCl胁迫下，与非转基因对照相比，5个转基因棉花株系株高提高2.5～4.4 cm，地上部分的鲜质量增加3.6%～11.8%；且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量提高。在盐胁迫条件下，转GHABF4基因棉花表现出优良的生长和生理优势，转GHABF4基因能够提高棉花的抗盐能力。

棉花；GHABF4转录因子；转基因棉花；耐盐性

土壤盐渍化严重影响植物了的生长发育，在农业生产上经常造成农作物大幅度减产[1]。因此，如何提高作物的耐盐性、增加盐胁迫下作物的产量，是人们关注的焦点。棉花是我国重要的经济作物，其主要种植在西北内陆、黄河流域和长江流域，形成三大主产棉区。棉花虽然是耐盐性较强的作物之一，但是棉花的常规品种耐盐能力只有0.3%左右，其耐盐能力仍然有限。土壤中过多的盐离子会对棉花产生离子毒害和渗透胁迫[2]。因此，进一步提高棉花耐盐能力是盐碱地能广泛种植棉花、扩大棉花种植面积的前提条件。为了较快获得品质优良的抗逆棉花品系，育种工作者通过基因工程手段对棉花进行了性状改良，以期能够提高棉花的抗逆能力。

转录因子是植物中广泛存在的一类与植物胁迫应答相关的基因，在调控植物应答非生物胁迫的过程中起着非常重要的作用。当植物受到外界高盐、干旱等刺激时，其体内会发出一系列胁迫应答信号，激发转录因子活性，响应胁迫调控。碱性亮氨酸拉链(Basic leucine zipper，bZIP)蛋白是真核生物转录因子中分布最广、最保守的一类蛋白，它参与植物对脱落酸、光和发育中各种信号的反应，在植物抵御逆境胁迫过程中起着非常重要的作用[3]。AREB/ABFs转录因子属于碱性亮氨酸拉链类蛋白中的A亚族。目前，AREB/ABFs类转录因子在拟南芥、烟草、小麦、大麦、花生、玉米、马铃薯等作物中均有报道，且已经从多种植物中克隆出AREB/ABFs类转录因子相关基因，并且成功导入棉花、烟草等植物中，从而获得具有抗旱耐盐能力的转基因植物新品系[4]。

为了提高棉花自身抗逆境能力，获得耐盐棉花新品系，山西省农业科学院棉花研究所生物技术研究课题组从陆地棉中克隆了耐盐转录因子基因GHABF4，并构建成了植物表达载体，通过农杆菌介导法转入陆地棉品种中棉35，获得了一定数量的转基因棉花株系，通过对5个转基因棉花株系(L1、L2、L3、L4、L5)和非转基因对照进行NaCl胁迫处理，研究处理后转基因棉花株系与非转基因对照的株高、地上部分的鲜质量、抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量的变化，旨在为进一步培育出耐盐棉花育种新材料奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料、菌株、载体 转基因棉花的受体材料是陆地棉品种中棉35；大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株为DH5α，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株为LBA4404；抗性筛选剂为利福平(Rif)，克隆载体为pGEM Teasy，表达载体为pBin438；抗性标记为卡那霉素(Kn+)，以上菌株和载体均由山西省农业科学院棉花研究所生物技术实验室保存。

1.1.2 培养基 基本培养基MSB：MS 无机盐，B5维生素，2×3.8 g/L KNO3，3%的葡萄糖，2.5 g/L的植物凝胶，pH值5.8。无菌苗培养基 MS0为1/2 MSB。共培养培养基MSB1：MSB+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L 2,4-D。愈伤组织诱导培养基MSB2：MSB+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L 2,4-D+50 mg/L卡那霉素+500 mg/L头孢菌素。愈伤组织增殖培养基为基本培养基MSB。分化培养基MSB3：MSB(去除NH4NO3)+1.0 g/L 谷胺酰氨(Asn)+2.0 g/L天门冬酰氨(Gln)，pH值 6.2，该培养基用于体细胞胚成熟和萌发及植株再生。LB液体培养基：酵母提取物(5 g/L)+胰蛋白胨(10 g/L)+NaCl(10 g/L)。

具体配置方法参见罗晓丽等[5]的方法进行。

1.2 试验方法

1.2.1 组培法棉花遗传转化 将经硫酸脱绒的陆地棉中棉35的种子用70%的乙醇表面消毒1 min后，用10%的过氧化氢浸泡3～4 h，再用无菌水冲洗3～4 次，浸泡于无菌水中至种子露白。在无菌条件下，将种子种于MS0 固体培养基上；5 d后，取其幼苗下胚轴作为外植体进行遗传转化试验；挑取含有目的基因和卡那抗性筛选基因的农杆菌LBA4404 单菌落，接种于含有卡那霉素(50 mg/L)和利福平(25 mg/L)的LB 液体培养基中，28 ℃ 过夜培养，至对数生长期，200 r/min对菌液进行离心，弃上清。用LB 液体培养基重悬菌体至菌液OD600≈0.3，以此作为浸染液。将下胚轴切成约1 cm 小段，浸于农杆菌菌液5～10 min，期间轻轻摇晃培养皿使菌液充分被吸收。之后用无菌滤纸吸干下胚轴残余的菌液，将下胚轴切段置入共培养培养基MSB1中48 h后，置入愈伤组织诱导培养基MSB2中，15 d左右可见有少量的愈伤组织，大约30～60 d可形成直径为10 mm左右大小的愈伤组织块，将其作为试验材料。每隔30 d换一次相同培养基MSB2。待长出愈伤后转入增殖培养基MSB继代培养3～5 次，至愈伤长成小米粒状时，将其挑出转入分化培养基MSB3中，愈伤分化成胚状体再长成幼苗需要90～120 d，期间每隔30 d更换一次MSB3培养基。对组培瓶里的幼苗进行卡那霉素初筛和PCR分子检测，将阳性幼苗通过嫁接方式移栽至温室。

1.2.2转化棉苗的卡那霉素涂抹筛选 将T0植株收获种子后种植于网室，每株收获种子后种植一行，进行卡那霉素抗性筛选，先采用2 000 mg/kg卡那霉素溶液均匀涂抹在3～5 片真叶棉花幼苗的幼叶正面，5～7 d 后观察被涂抹叶片变色情况，淘汰叶片变黄的植株。30 d后，卡那霉素筛选增加到3 000 mg/kg，分别对非转化和转化棉株叶片进行第2 次卡那霉素抗性检测，淘汰棉花叶片变黄的植株。

1.2.3 基因组DNA提取及PCR检测目的基因 挑选经卡那霉素 2 次筛选鉴定均呈抗性的转化棉株新鲜叶片作为材料，利用改良的CTAB 法提取基因组DNA；以此DNA 为模板，并根据GHABF4的基因序列设计引物ABF4-F：5′-GAAGATCTATGGGGTCTAATCTGAATTTC-3′，ABF4-R：5′-ACGCGTCGACCTACCAAGGGCCTGTCAG-3′进行PCR扩增。PCR 反应条件：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72℃延伸90 s，35 个循环；最后 72℃延伸 10 min。1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 盐胁迫对棉花幼苗的影响 转基因棉花T3的 5个株系分别种植在含有蛭石的花盆中，以非转基因棉花中棉35为对照，当棉花长出3片真叶时，开始进行盐胁迫处理，刚开始用50 mmol/L的NaCl溶液浇灌植株(设置清水对照)，5 d 后逐步提高到200 mmol/L浓度进行浇灌，每5 d 浇一次溶液，连浇3 次；第3次浇灌后的第5天取棉花新鲜叶片测定相关指标，并观察植株的生长情况，统计棉花植株的株高和地上部分的单株鲜质量。每个处理 10 株，重复 3 次。1.2.5 转基因植株的生理生化分析参照邹琪[6]的植物生理学实验指导进行指标分析。其中，超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用NBT 光化还原法；过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用高锰酸钾滴定法；非特异性过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚显色法，叶绿素含量的测定采用乙醇丙酮法[7]。

1.3 数据分析

数据采用Microsoft Excel 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 转基因棉株卡那霉素(Kn+)的抗性鉴定与筛选

由于目标基因构建时带有NPT-Ⅱ标记基因，因此，转化植株和非转化植株用卡那霉素涂抹幼苗，以叶片反应情况来进行初步筛选。用2 000 mg/kg 浓度卡那霉素溶液涂抹棉苗的幼叶，进行第一次筛选，图1显示了7 d后转化植株和非转化植株的叶片反应情况。30 d后，用3 000 mg/kg浓度的卡那霉素进行再次鉴定。

图1 T1植株卡那霉素筛选Fig.1 Kanamycin resistance screening in T1

2.2 PCR 分析

挑选经卡那霉素 2 次筛选鉴定均呈抗性的转化棉株的新鲜叶片作为材料，以非转基因材料为对照进行目的基因检测。通过 PCR 扩增，结果表明，GHABF4 基因已经被整合到转化植株的基因组中(图2)。经过卡那霉素和PCR分子检测，获得T3转基因棉花纯合系。

-. 阴性对照；M. DL2000 Marker；P. 质粒；1～8. 转化植株。 -. Negative control；M. DL2000 Marker；P. Plasmid；1-8. Transgenic plants.

2.3 转基因纯合系的耐盐分析

转基因植株的耐盐性检测结果显示，200 mmol/L NaCl胁迫下，转GHABF4基因棉花株系的生长表型比非转基因对照长势强，株高比对照提高2.5～4.4 cm，地上部分的鲜质量比对照增加3.6%～11.8%，非转基因棉花叶片有少许脱落，说明GhABF4 基因的导入提高了棉花植株对盐碱的抗性(图3，4 )。

图3 NaCl胁迫下转基因棉花与对照株高比较Fig.3 Comparison of transgenic cotton and control plants under NaCl stress

图4 NaCl胁迫下转基因棉花与对照植株鲜质量比较Fig.4 Comparison of fresh weight between transgenic cotton and control plants under NaCl stress

2.4 转基因棉花的生理生化分析

2.4.1 NaCl胁迫对转基因和对照棉花体内抗氧化酶活性的影响 植物在受到盐胁迫时，植物体内活性氧代谢加强，SOD 可协同其他相关酶如CAT、POD等共同防御活性氧和过氧化物自由基对细胞膜的伤害，其活性与植物的代谢强度及抗逆能力密切相关。因此，本研究通过测定 SOD、CAT和POD 活性大小来推断棉花受胁迫伤害程度[8-9]。转基因棉花的酶活性结果显示，在棉花植株没有受到胁迫之前，转基因植株和非转基因对照的SOD、CAT、POD之间并没有太大的差异；而在200 mmol/L NaCl胁迫下，转基因植株的SOD、CAT和POD活性明显高于非转基因对照，其中，品系L2的SOD 活性达到最大值 (80.3 U/g)，约为处理后对照组的1.23倍；品系L4的CAT活性达到最大值(342 U/g)，约为处理后对照组的1.58倍；品系L1的POD活性达到最大值(1 580 U/g)，约为处理后对照组的1.31倍(图5)。说明在盐胁迫诱导基因表达时，GHABF4 基因能上调植株体内氧化酶活性，从而使活性氧含量增加。

图5 NaCl胁迫下转基因棉花与对照植株SOD、CAT、POD比较Fig.5 Comparison of POD，CAT and SOD between transgenic cotton and control plants under NaCl stress

2.4.2 NaCl处理对棉花叶绿素含量的影响 植物在受到盐胁迫时，光合色素含量减少，使得光合作用减弱，最终导致植物的生长发育受阻[10]。盐胁迫结果显示，在正常生长条件下，各转基因棉花叶片的绿素含量均在4.0～7.3 mg/g，而200 mmol/L NaCl处理 20 d后，非转基因对照棉花严重失绿，叶绿素含量降低，而转基因棉花植株叶绿素含量明显高于对照，品系L3的叶绿素含量达到4.3 mg/g，约为处理后对照组的2.26倍。说明盐胁迫能够严重影响非转基因棉花植株的叶绿素含量，而对转基因棉花的叶绿素含量影响较小(图6)。

图6 NaCl胁迫下转基因棉花与对照植株叶绿素含量比较Fig.6 Comparison of chlorophyll content between transgenic cotton and control plants under NaCl stress

3 讨论

植物的生长发育往往受到环境中各种生物和非生物因素的影响，其中，高盐、干旱、低温等非生物胁迫已经严重影响了农作物的生长水平和产量[11]。利用基因工程方法获得耐盐植物新品系、新材料的研究越来越广泛，且参与胁迫应答的很多功能基因已经被鉴定出来[12]。有研究表明，转ScALDH21 基因棉花表现出优良的生长和生理优势，转ScALDH21 基因能提高棉花的抗盐能力[13]。将水通道蛋白聚合基因ZmPLC1-betA转化棉花，转基因棉花在干旱胁迫下的相关生理指标及农艺性状均优于对照，表现出更强的耐旱性[14]。转菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因(SoBADH)株系在盐胁迫下比对照长势强，株高和地上部分的鲜质量显著高于非转基因对照，在低温胁迫下，这些转基因株系表现出显著的抗冻性能。菠菜甜菜碱醛脱氢酶能够在棉花中过量表达，并具有较高的酶活性，提高了棉花的耐逆性[15-16]。

本研究通过农杆菌介导法将GHABF4转录因子基因整合到棉花中，通过对转基因植株T3材料进行盐胁迫来鉴定其耐盐性，结果表明，转基因棉花受盐胁迫后，株高比对照提高，地上部分的鲜质量比对照增加，抗氧化物酶SOD、POD、CAT等的活性以及叶绿素的含量高于非转基因对照；在盐胁迫条件下，转入GHABF4基因在一定程度上提高了植株的耐盐性，使棉花获得较高的耐盐性。说明GhABF4基因参与了棉花对盐胁迫的应答反应，为棉花耐盐研究提供一定的理论依据[17-20]。

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Study on the Salt Tolerance of TransgenicGHABF4 Transcription Factor Cotton Plants

ZHANG Anhong1,2，WANG Zhian1，XIAO Juanli1，LUO Xiaoli1,2

(1.Cotton Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Yuncheng 044000，China；2.Shanxi Key Laboratory of Cotton Germplasm Resources Utilization and Molecular Design Breeding，Yuncheng 044000，China)

AREB/ABFs transcription factor family genes are mainly involved in drought，high salt，low temperature and other stress response. To obtain the high salt tolerance level of cotton germplasm. The salt tolerance of transcription factor gene ofGHABF4 was transformated into cotton inbred Zhong 35 plant by Agrobacterium-mediated method. Transgenic plants in T1，T2and T3were detected by kanamycin resistance screening，PCR.Pure transgenic lines were obtained from T3.Salt tolerance analysis was carried out on 5 T3transgenic cotton lines and non transgenic cotton plants by salt stress test. The results showed that under 200 mmol/L NaCl stress，compared with non transgenic lines，5 transgenic cotton plant height increased from 2.5 to 4.4 cm，on the part of the fresh quality increased by 3.6%-11.8%，antioxidant enzyme SOD，POD，CAT activity and chlorophyll content were higher than the control. The results of this study showed that under salt stress，the transgenicGHABF4 cotton showed good growth and physiological advantages，and the transgenicGHABF4 gene could enhance the salt tolerance of cotton.

Cotton；GHABF4 transcription factor；Transgenic cotton；Salt tolerance

2017-06-14

山西省农业科学院农业创新研究课题(ZDSYS1501)

张安红(1977-)，男，山西稷山人，助理研究员，硕士，主要从事植物基因工程研究。

罗晓丽(1963-)，女，甘肃临洮人，副研究员，主要从事植物基因工程研究。

S562.03；Q78

A

1000-7091(2017)04-0055-05

10.7668/hbnxb.2017.04.009