大白菜根肿病的遗传规律及抗病基因定位研究

张 红，张 斌，闻凤英，刘晓晖，王超楠，李 梅，黄志银

(天津科润蔬菜研究所，蔬菜种质创新国家重点实验室，天津市蔬菜遗传育种企业重点实验室，天津 300384)

大白菜根肿病的遗传规律及抗病基因定位研究

张 红，张 斌，闻凤英，刘晓晖，王超楠，李 梅，黄志银

(天津科润蔬菜研究所，蔬菜种质创新国家重点实验室，天津市蔬菜遗传育种企业重点实验室，天津 300384)

为探究根肿病抗病遗传规律，采用根肿病抗性差异的材料G57和G70，构建了包含500个单株的F2分离群体。通过对父母本、F1及F2分离群体的人工接种表型鉴定结果进行统计分析，结果发现，材料中的根肿病抗性由显性单基因控制。为进一步定位试验材料中的抗病基因，利用678个分子标记对双亲、F1及F2群体进行了筛选验证，初步将抗病基因定位在分子标记KBRH129J18和TCR02-F。并基于2个连锁标记，开发设计了更紧密连锁的分子标记，最终获得与抗病基因连锁的5对SSR分子标记，分别为Bra0345-1、Bra0235-2、Bra0235-1、Bra19317、Bra019392。其与抗病基因的遗传距离依次为2.4，2.4，2.4，2.5，3.3 cM。开发设计的多态性标记经验证在大白菜中具有较好的适用性。

大白菜；根肿病；抗病遗传规律；抗病基因；分子标记

根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron) 侵染引起的一种世界性病害[1-2]，主要危害大白菜等十字花科蔬菜，最常见的病症是在受侵染根部形成明显的肿瘤。该病最初在 1737 年英国地中海西岸和欧洲南部发现，随后在世界各地十字花科蔬菜种植区蔓延。感病植物根部释放的休眠孢子在土壤中可存活长达 20 年，且发病初期地上部分症状不明显，不易检测，很难根治，又有“根癌”之称，已成为世界性难题。

近年来，针对根肿病害防治的手段主要为农艺防治、生物防治、化学防治及抗病育种等。研究者们从环保、经济等方面考虑，通过不断实践发现进行抗病品种的育种是目前防治该病害最理想的方法[3]。随着现代分子技术的不断发展，在育种工作中利用分子标记技术定位抗病基因来辅助选择育种的优势日益凸显。目前，研究者们利用分子技术定位的大白菜抗根肿病基因已有8个，分别是Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和CRk[4-11]，其中Crr1定位于A8连锁群，Crr2定位于A1连锁群，Crr4定位于A6连锁群，CRc定位于A2连锁群，Crr3、CRa、CRb、CRk定位于A3连锁群。Saito等[12]通过与拟南芥的比较精细定位了Crr3基因，且证明Crr3与CRb不是同一位点。Diederichsen等[13]提出CRa与CRb可能是等位基因或紧密连锁的2个抗病基因位点，Crr3与CRk可能也是等位基因或紧密连锁的2个抗病基因位点。随着分子技术的发展，近年来逐渐开发设计的一些与大白菜抗根肿病紧密连锁的分子标记数量仍然有限，在一定程度上限制了分子标记辅助育种，同时研究者们由于所用材料的差异及抗病基因的不同，所开发的标记通用性不强，难以满足育种实践的需要。因此，针对性的开发与大白菜抗根肿病基因紧密连锁的分子标记，采用分子标记辅助选择将对培育出优质大白菜抗根肿病品种有着极大的帮助。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试菌株为采自云南省昆明市嵩明县的大白菜根肿病发病肿根。遗传规律研究及基因定位试验中的材料，主要由天津科润蔬菜研究所提供，包括根肿病极抗材料G57、极感材料G70及杂交获得的F1，利用F1自交构建了包含500个单株的F2分离群体。分子标记的适用性验证试验中使用的材料共计54份。包括16份商业品种及38份由含抗病基因F1小孢子培养得到的DH系。

所有供试材料均播种于天津科润蔬菜研究所的温室内，待幼苗长到 5～6 片真叶时取样，并保存于-80 ℃备用。

分子标记引物来源：共计678个分子标记引物，包括14个与大白菜根肿病抗病基因连锁的分子标记引物[14]，王艳[15]构建的大白菜遗传图谱中的415个InDel和92个SSR引物标记，来自大白菜基因组的144个SSR引物标记，根据Brassica Database(http：//brassicadb.org)的数据，分析序列信息，设计合成13个SSR分子标记。以上引物均由南京金斯瑞有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 根肿病人工接种鉴定方法 接种鉴定试验在天津科润蔬菜所温室进行。按比例将制备好的休眠孢子液和无菌土混合，使菌土孢子含量达到108个/g，将pH值调至6.5，含水量控制在60%左右，然后将配好的菌土置入装满灭菌营养土的育苗穴盘中，把试验材料种子播于穴盘菌土内，其中抗感亲本、F1各25株，F1自交构建的F2群体500株，少量蛭石覆盖。苗盘置于温室，25 ℃下生长，避免阳光长时间直晒，苗盘下保持1 cm水层，30 d后调查发病情况。

1.2.2 大白菜DNA的提取及检测采集 亲本、F1及F2材料的嫩叶，参照文献[16-17]的CTAB法进行改良提取大白菜DNA，提取得到的大白菜基因组DNA的质量利用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。再取1 μL DNA溶液在分光光度计上测定其浓度和纯度，其中DNA的OD260/280值需保持介于1.8～2.0。最后用蒸馏水将DNA原液稀释到50 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1.2.3 多态性标记的筛选 产物扩增采用20 μL的PCR标准反应体系进行。具体PCR反应体系如表1所示。

表1 大白菜PCR标准反应体系Tab.1 Standard PCR reaction system of Chinese cabbage

PCR扩增后产物采用 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，将具有多态性的标记使用快速银染法[18]进行检测。

1.2.4 分子标记的开发及抗病基因的定位 利用Join Map 4.0软件，统计F2单株的电泳扩增条带并构建遗传连锁图，同时结合大白菜数据库(http://brassicadb.org/brad/)的信息，利用Primer 5.0软件在抗病基因附近设计新的分子标记，进一步逼近抗病基因。

分子连锁图谱的构建采用了JoinMap 4.0软件，操作如下：

创建新文件夹：点击“New Project”命令；②数据录入：根据亲本的带型来确定多态性条带，与感病亲本带型相同的条带记为“a”，与抗病亲本带型条带相同的记为“b”，杂合带型记为“h”，由于其他原因造成的条带不清或缺失的赋值“-”。点击“Load data”命令导入分子标记的条带数据，选择“Individual genotfreq”选项排除缺失数据过多的单株；③数据分析：点击“Calculate”分析分子标记的偏分离情况，设置LOD=3，并选择“Group”进行分组，最后点击“Map”命令构建遗传连锁图，采用Kosambi函数进行图距计算。

1.2.5 分子标记的适用性验证 利用开发设计的分子标记扩增16份商业品种及38份DH系材料，记录电泳条带，将与感病亲本相同的电泳带型标记为a，与抗病亲本相同的电泳带型标记为b，杂合带型标记为h。最后进行田间鉴定及分子试验结果统计。

2 结果与分析

2.1 大白菜根肿病人工接种鉴定结果与遗传学分析

依据整理的病情分级标准[19]，对高抗病亲本材料G57、高感病亲本材料G70、F1以及由F1自交构建的包含500个单株的 F2分离群体进行人工接种的表型鉴定(图1，2)，结果发现：25株G57均表现抗病、25株G70均表现为感病、25株F1均表现不同程度的抗病、500株F2群体中抗性发生分离，其中含抗病单株367株和感病单株133株(表2)。经卡方检测，χ2=P>0.05=0.68，抗感病表型符合3∶1的分离比，遵循孟德尔遗传定律，说明该材料中抗病性受显性单基因控制。

从左至右，依次为感病亲本G70，抗病亲本G57，F1。 From left to right，followed by the susceptible parent G70，resistant parent G57,F1.

从左至右，依次为F2分离群的401～410单株。From left to right，followed by F2 isolates of 401-410 plants.

材料编号Materialnumber病情分级Diseaseclassification0级0level1级1level3级3level5级5level7级7level总株数Totalnumber抗病∶感病实际比值Actualratio抗病∶感病理论比值Theoryratioχ2检验χ2inspectionG572500002525∶01∶0-G70000223250∶250∶1-F11870002525∶0--F2244123683233500367∶1333∶10.68

2.2 样品DNA质量的检测

结果如图3所示：样品DNA条带分明，无明显的弥散现象，无RNA和多糖污染，符合后续试验对DNA模板的要求。

M.Marker；1～5.F2群体不同单株。 M.Marker;1-5.Different segregation of F2 lines.

样品DNA浓度曲线标准且OD260/280均为1.8～2.0，样品DNA质量合格，PCR过程样品DNA浓度需稀释至50 ng/μL。

2.3 多态性分子标记的筛选结果

本研究利用抗感亲本及F1对与根肿病抗性基因紧密连锁的14对分子标记、均匀分布在10条染色体上的236对SSR标记及415对InDel标记进行多态性筛选，如图4中箭头所指为多态性分子标记的引物扩增条带，经筛选得到均匀分布在10条染色体上的62对表现多态性、重复性好的分子标记。

为避免BSA法易出现的假阳性问题，本研究在F2分离群体中选取24株极抗单株和24株极感单株组成48株极端表型群体，将获得的62个多态性标记在48个单株中进行验证，得到7个连锁标记(图5)，分别为BRID90039、BRID90430、BRID10401、B4732、KB59N03、TCR74、KBRH129J18。7对分子标记主要位于A03染色体上且部分为已报道的CRb基因的连锁分子标记，初步推断试验所选材料含CRb基因。

图4 父母本、F1间多态性分子标记的筛选Fig.4 Screening of polymorphic markers between the parents and F1

前面的泳道表示F2群体中选出的24株感病单株;后面的泳道表示24株抗病单株。 Lane said in front of F2 population selected 24 strains infected individual;24 strains representing behind resistance per plant.

进一步深入检索文献，查找与CRb相连锁的分子标记，经过多态性筛选及在48株极端表型群体中进行验证，又得到连锁标记5对。为降低人工接种鉴定表型统计的误差，将F2群体中抗病性为1级和3级的单株剔除，只保留极端抗病和极端感病的309株组成新的F2群体，将之前获得的12对连锁标记在309株F2群体中进一步验证，并应用JoinMap 4.0软件构建遗传连锁图(图6)，CR基因的两侧翼标记为KBRH129J18和TCR02_F。

图6 多态性引物构建的遗传图谱Fig.6 Genetic map construction with polymorphism primers

2.4 新抗根肿病分子标记的开发及抗病基因的定位

通过筛选与抗病基因相连锁的分子标记，初步定位了抗病基因的位置，在此基础上利用大白菜数据库(http://brassicadb.org/brad/)的基因组信息，搜索到两侧翼分子标记区域内的SSR序列及该区域内的基因注释信息，采用Primer 5.0软件在初定位的抗病基因附近设计了13对SSR分子标记引物(表3)。

表3 SSR分子标记引物Tab.3 SSR molecular marker primers

将新设计的13个SSR标记在亲本及48株极端表型群体中进行初步筛选验证，获得与抗病基因连锁的5对SSR分子标记，分别为Bra0345-1、Bra0235-2、Bra0235-1、Bra19317、Bra019392。进一步在309株F2分离群体中进行验证，利用JoinMap 4.0软件绘制遗传连锁图。结果显示，在遗传连锁图中5对分子标记与抗病基因的遗传距离依次为2.4，2.4，2.4，2.5，3.3 cM(图7)。经Brassica Database(http://brassicadb.org/brad/)信息查询抗病基因CR两侧翼分子标记在大白菜基因组中的物理位置，将抗病基因初步定位到物理距离为24.75～24.81 Mb的区域内。

图7 新设计的多态性引物构建的遗传图谱Fig.7 Genetic map construction with the new design of polymorphism primers

2.5 分子标记的适用性分析

为验证与抗病基因紧密连锁的标记Bra0235-2和Bra19317在白菜中的适用性。利用两分子标记扩增了相应材料的DNA，结果如图8，9，所有DH系的电泳条带类型与表型均一致，抗病株系与抗病亲本G57一致，感病株系与感病亲本G70条带一致，说明新开发的分子标记对本试验所用抗病基因有很好的适用性，可用于后续分子标记辅助选择育种。在16份商业品种中有10份表型和电泳条带类型一致(表4)，而本试验编号为C42、C47、C48、C49、C51和C52的抗根肿病商业品种的表型与分子标记的带型不同，推测这6个商业品种所含抗病基因与本试验所用材料的抗病基因不同。

图8 分子标记 Bra0235-2在部分DH系中的银染结果Fig.8 Silver stain result of molecular markers Bra0235-2 in the part of the DH system

图9 分子标记 Bra0235-2在部分商业品种中的银染结果Fig.9 Silver stain result of molecular markers Bra0235-2 in the part of the commodity

试验编号Testnumber名称Name来源Source表型PhenotypicBra0235-2Bra193171DH系Rbb2DH系Rbb3DH系Rbb4DH系Rbb5DH系Rbb6DH系Rbb7DH系Rbb8DH系Rbb9DH系Rbb10DH系Rbb11DH系Rbb12DH系Rbb13DH系Rbb14DH系Rbb

表4(续)

注：a.与感病亲本相同的电泳带型;b.与抗病亲本相同的电泳带型;h.杂合带型。

Note：a.The same as the infected parent type electrophoresis;b.Hybrid type the same as the infected parents electrophoresis;h.Hybrid type.

3 结论与讨论

3.1 关于大白菜人工接种鉴定及遗传学分析

本试验对抗病亲本、感病亲本、F1及F2群体进行人工接种抗性鉴定，经数据统计发现，本试验中根肿病抗性受显性单基因控制，这与赵卓[20]的研究相符。但不同试验材料中大白菜的抗根肿病的遗传规律不同。也有部分试验研究显示根肿病的抗性呈数量遗传，受多基因控制。

国内外人工接种抗病鉴定的方法主要是对材料发病表型进行人为分级，分级标准不一，目前，人工接种鉴定过程也主要依靠目测，大量的材料鉴定极容易受到主观因素的影响而产生视觉误差。根肿病的接种条件对发病结果也存在很大影响，而在试验过程很难保证接种条件的一致性，导致根肿病的抗性鉴定结果难免存在一些偏差。今后根肿病的接种鉴定方法仍需完善。

3.2 关于大白菜抗病基因的定位

本研究利用309个单株构建的F2分离群体，开发了5个与抗根肿病基因连锁的分子标记，分别为Bra0345-1、Bra0235-2、Bra0235-1、Bra19317、Bra019392。它们与抗病基因的遗传距离依次为2.4，2.4，2.4，2.5，3.3 cM。最终验证分子标记在大白菜中的适用性较强，可应用于MAS育种中。

选择适宜规模的群体，是基因定位的基础。通常粗定位对群体规模要求不高，达到200株左右即可；但精细定位则需要较大群体，常常需要达到上千株，有的甚至上万。本研究选取500个单株构建的F2群体，对于基因精细定位，所建群体仍然过小。因此，要实现对基因的更精细的定位还需要加大群体的规模。为尽量降低表型鉴定过程中人工分级带来的误差，仅在构建图谱时从500个单株的群体中剔除了共计191株1级和3级病情的单株，在一定程度上对于基因定位的准确度和精细度造成了影响。

对于尚无连锁图或连锁图饱和程度较低的植物，利用BSA法是快速获得与目标基因连锁的分子标记的有效方法。但假阳性现象即非连锁的标记在两池内出现多态性条带是BSA法的一大障碍，这种现象虽然可以通过增加混池单株数来降低，但却不能完全消除。因此，本试验直接选择48株F2群体内的极端表型单株对分子标记进行筛选验证，有效地避免了BSA法的假阳性问题，而且相对于大群体的筛选验证，工作量更小，效率更高。

本试验通过父母本、F1及48株极端表型单株对678对分子标记进行筛选验证，获得7对与抗根肿病基因连锁的分子标记，它们主要位于A03染色体上且部分为已报道过的CRb基因的连锁分子标记，因此，本试验所选材料所含抗根肿病基因有可能是CRb基因。赵卓[20]利用3个共显性标记TCR01、TCR05及新开发的cnu_m413对大白菜抗根肿病基因CRb进行初步定位，并通过绘制抗根肿基因的物理图谱，最终用两侧翼标记TCR79和TCR108将CRb定位于大白菜A03连锁群23.6～23.7 Mb的位置。日本学者Kato等[21]则以CRShinki F1作为基因抗源材料并构建F2群体，通过SSR标记和InDel标记，最终将CRb基因定位到位于大白菜A03连锁群的24.2～24.3 Mb的位置上。本研究中初步定位的CR基因的位置为24.75～24.81 Mb，更接近于Kato等[21]的定位结果。

[1] 田雅琳. 十字花科根肿病研究现状及未来趋势[J].天津农业科学, 2015, 21(4):123-126.

[2] 索 欢, 陈龙正, 徐 海,等. 十字花科根肿病研究进展[J].安徽农业科学, 2015(14):115-117.

[3] 罗延青，李劲峰，俎 峰，等.芸薹属作物根肿病抗性遗传研究进展[J]. 安徽农业科学，2011，39(31)：19162-19163.

[4] Vegetable A,Center D,Talelear,et al. Chinese Cabbage：proceeding of the first international symposium[J].Journal De Pediatria，1987，81 (1)：65-72.

[5] Suwabe K,Tsukazaki H,Iketani H,et al.Identification of two loci for resistance to clubroot (PlasmodiophorabrassicaeWoronin) inBrassicarapaL.[J].Theoretical and Applied Genetics.2003,107(6)：997-1002.

[6] Suwabe K,Tsukazaki H,Iketani H,et al. Simple sequence repeat-based comparative genomics betweenBrassicarapaandArabidopsisthaliana：the genetic origin of clubroot resistance[J]. Genetics,2006,173(1)：309-319.

[7] Hirai M,Harada T,Kubo N,et al，A novel locus for clubroot resistance inBrassicarapaand its linkage markers[J].Theoretical and Applied Genetics,2004,108(4)：639-643.

[8] Matsumoto E,Yasui C,Ohi M,et al. Linkage analysis of RFLP markers for clubroot resistance and pigmentation in Chinese cabbage[J]. Euphytica,1998,104(2)：79-86.

[9] Sakamoto K,Saito A,Hayashida N,et al.Mapping of isolate-specific QTLs for clubroot resistance in Chinese cabbage (BrassicarapaL.ssp.pekinensis)[J].Theoretical and Applied Genetics,2008,117(5)：759-767.

[10] Piao Z Y,Park Y J,Choi S R,et al.Conversion of AFLP marker linked to clubroot resistance gene into SCAR marker[J].Journal of the Korean Society Horticultural Science,2002,43(6)：653-659.

[11] Piao Z Y,Deng Y Q,Choi S R,et al.SCAR and CAPS mapping ofCRba gene conferring resistance toPlasmodiophorabrassicaein Chinese cabbage (Brassicarapassp.pekinensis)[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004,108(8)：1458-1465.

[12] Saito M，Kubo N，Matsumoto S，et al.Fine mapping of the clubroot resistance gene,Crr3，inBrassicarapa[J] .Theoretical and Applied Genetics，2006,114(1)：81-91.

[13] Diederichsen E,Frauen M,Linders E G,et al.Status and perspectives of clubroot resistance breeding in crucifer crops[J].Journal of Plant Growth Regulation，2009,28：265-281.

[14] 王彤彤，张淑江，章时蕃，等.大白菜根肿病抗性基因的标记和定位[J].中国蔬菜，2012(14)：31-35.

[15] 王 艳.白菜参考遗传图谱的构建[D].北京：中国农业科学院，2011.

[16] 丁 浩,郑唐春,梁德洋,等. 一种简易高效提取多种植物纯净DNA的方法[J]. 植物研究, 2015, 35(3):457-461.

[17] Narzary D,Verma S, Mahar K S, et al. A rapid and effective method for isolation of genomic DNA from small amount of silica-dried leaf tissues[J].National Academy Science Letters, 2015, 38(5):441-444.

[18] 尤伟静, 陈 茂, 马卫德,等. 琼脂糖凝胶中DNA检测方法的研究进展[J].中国医药生物技术, 2012, 07(1):43-46.

[19] 张 红，张 斌，王超楠，等.青麻叶大白菜根肿病人工接种方法及条件研究[J].华北农学报，2016，31(1)：182-185.

[20] 赵 卓.大白菜根肿病抗性基因的分子标记及定位[D]. 北京：中国农业科学院，2012.

[21] Kato T,Hatakeyama K,Fukino N,et al.Identificaiton of a clubroot resistance locus conferring resistance to aPlasmodiophorabrassicaeclassified into pathotype group 3 in Chinese cabbage (BrassicarapaL.)[J]. Breeding Science，2012,62(62)：282-287.

Chinese Cabbage Root Disease Genetic Law and Positioning of Resistance Genes Research

ZHANG Hong，ZHANG Bin，WEN Fengying,LIU Xiaohui,WANG Chaonan，LI Mei，HUANG Zhiyin

(Tianjin Kernel Vegetable Research Institute，State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation,Tianjin Vegetable Genetics and Breeding Enterprise Key Laboratory,Tianjin 300384,China)

To explore the root disease resistance genetic regularity，by root disease resistance difference material，G57 and G70，the F2segregation population containing 500 per plant was built.Through artificial inoculation of the parents，F1and F2segregation population phenotypic characterization results were statistically analyzed. The results showed that root disease resistance of materials was controlled by a single dominant gene. In order to further localization of resistance genes in test materials，we used 678 molecular markers of parents，F1and F2population screening verification，resistance genes was preliminarily located in molecular marker KBRH129J18 and TCR02-F.This test was based on two chain tags，chain development design closer chain of molecular markers，ultimately with resistance genes chain 5 of SSR molecular markers,respectively，Bra0345-1，Bra0235-2，Bra0235-1，Bra19317，Bra019392. Their genetic distance with resistance genes were 2.4，2.4，2.4，2.5，3.3 cM.Validated，development and design of polymorphism markers in Chinese cabbage had good applicability.

Chinese cabbage；Root disease；Disease resistance genetic law；Resistance genes；Molecular markers

2017-07-12

国家重点研发计划项目(2016YFD0101701)；国家现代农业产业技术体系项目(CARS-25-G-02)；天津市自然科学基金项目(16JCYBJC29300)；天津市科技创新体系及平台建设计划项目(16PTSYJC00260)；农业部“农业科研杰出人才培养计划”项目

张 红(1990-)，女，天津武清人，研究实习员，硕士，主要从事大白菜分子育种研究。

张 斌(1965-)，男，辽宁本溪人，研究实习员，研究员，博士，主要从事十字花科蔬菜育种研究。

S634.1

A

1000-7091(2017)04-0060-07

10.7668/hbnxb.2017.04.010