高温条件下CO2对黄瓜SOD、POD和CAT活性及其基因表达的影响

张之为，李晓静，白金瑞，陈 帅，范梦轩

(内蒙古农业大学 农学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

高温条件下CO2对黄瓜SOD、POD和CAT活性及其基因表达的影响

张之为，李晓静，白金瑞，陈 帅，范梦轩

(内蒙古农业大学 农学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

为了探索高温条件下，CO2对保护酶SOD、POD和CAT活性及其基因相对表达量的影响，以温室嫁接黄瓜为材料，研究高温条件下，CO2处理后黄瓜叶片中SOD、POD和CAT活性及其基因相对表达量的变化趋势。结果显示，高温条件下，CO2处理增加了黄瓜叶片SOD、POD和CAT的活性。与常温处理相比，高温结合CO2处理黄瓜的SOD、POD和CAT活性分别在处理42，28，21 d时差异最大，分别增加了19.1%，50.4%和45.0%。利用Real-time PCR分析SOD、POD和CAT基因相对表达量，结果显示，高温条件下，CO2处理增加了黄瓜叶片的SOD、POD和CAT基因的相对表达量。 高温结合CO2处理中黄瓜的SOD、POD和CAT基因相对表达量分别在处理28，28，21 d时达到最大值，比常温处理增加了60.7%，70.3%和44.9%。结果表明，高温结合CO2处理增加了温室黄瓜SOD、POD和CAT的活性及其基因的表达水平。

黄瓜；高温；CO2；抗氧化酶；基因表达

黄瓜(CucumissatiuvsL.)栽培面积广泛，在我国蔬菜生产中占有非常重要的地位。随着设施蔬菜产业不断发展壮大，设施内黄瓜生产面积也不断增加，目前，黄瓜的设施生产面积已经占我国温室生产总面积的50%左右[1]。但是，由于夏季设施内形成的高温环境，严重影响了设施黄瓜产量。长期的高温环境，易使黄瓜的生理代谢紊乱，导致其生长受到抑制、植株早衰，最终影响产量和品质[2-3]。因此，增强黄瓜植株对高温的耐受性是夏季设施生产中一个急需解决的问题。

高温条件下，植物细胞内的活性氧(ROS)积累量增加，产生膜脂过氧化作用，破坏了植物细胞膜系统[4-6]。同时，为了避免这些伤害，植物细胞内也存在着清除这些有害物质的酶类，它主要由过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)组成，它们在清除活性氧、维护细胞膜结构完整性等过程中起着重要作用[7-9]。大量研究发现，植物细胞中的CAT、POD和SOD等细胞膜保护酶与植物的耐热性有关，在高温胁迫下植物通过提高抗氧化酶活性清除过多的ROS，维持细胞正常代谢。何晓明等[10]研究发现，耐热品种中黄瓜幼苗的SOD活性高于不耐热品种。在设施黄瓜和番茄的研究中发现，高温胁迫下黄瓜和番茄植株的CAT、POD和SOD活性随温度升高而增加[11]。在花生中，高温处理后幼苗中SOD的活性显著增加[12]，甜椒中高温处理后，不同品种中的SOD和POD活性均增加，而且耐热品种的SOD和POD活性始终高于不耐热品种[13]。这些研究均表明，植物能够通过提高CAT、POD和SOD活性增加其对高温的耐受力。在研究高温与CO2协同作用中发现，CO2加富处理增加了茄子的CAT、POD和SOD活性，缓解高温对其造成的伤害，使茄子的光合速率在高温条件下仍维持较高水平[14]。高温条件下，黄瓜的光合速率由于高温胁迫而受到抑制[15]；但是，高温与CO2协同作用中黄瓜的光合速率却增加[16-19]，说明高温条件下，CO2增加了黄瓜的耐热性，缓解高温对黄瓜产生的伤害。

本试验以温室嫁接黄瓜为材料，研究高温条件下，CO2处理对黄瓜叶片中CAT、POD和SOD活性及其基因表达的影响，以期建立高温条件下，CO2处理与黄瓜CAT、POD和SOD活性及其基因表达丰度之间的关系。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以温室嫁接黄瓜为研究材料，砧木选用云南黑籽南瓜，接穗为津优36号黄瓜。试验于2014年进行，采用穴盘育苗的方式，于3月25日播种育苗，4月12日嫁接，5月10日定植于日光温室，栽培方式为双行垄作，株行距为40 cm×50 cm。

1.2 材料处理

试验设置了3个处理：即常温处理(按照常规温室黄瓜的栽培管理方式，每天9：00-17：00时进行通风换气，其他时间不进行通风换气)、高温处理(通风口关闭，使温室内温度迅速升高，当温度大于45 ℃时，采用小口换气的方式降低温室内温度，晴天使温室内温度达到40～50 ℃，每天维持4～5 h)和高温+ CO2处理(通风口关闭，同时施放CO2，当温度大于45 ℃时，采用小口换气的方式降低温室内温度，晴天使温室内温度达到40～50 ℃，CO2浓度在1 000～1 500 μL/L，每天维持4～5 h，阴天不进行CO2施肥处理)。不同处理在同一间温室内进行，用塑料膜隔开，使其成为相互独立的小区。小区面积为24 m2，每个处理设1个小区，3次重复。

CO2产生采用乌兰察布市慧明科技有限公司生产的AⅠ 型二氧化碳发生器。施放时间为5月20日，每天从9：00开始，每隔2 h向二氧化碳发生器中加入5～7 kg 碳酸氢铵以维持试验所需CO2浓度。于处理7 d时选择晴天进行取样，采取从顶部向下数第3～4片叶测定相应指标，每隔7 d采样一次，连续测定 6 次，测定时间为11：00时，每个处理测定3个植株，每株3次重复。

1.3 试验方法

1.3.1 SOD、POD和CAT活性测定 SOD 活性采用 NBT 光化还原法测定，以抑制 NBT光化还原的 50% 所需酶量为 1 个活力单位[20]；POD 活性采用愈创木酚法测定，以1 min内OD470变化 0.01为 1 个过氧化物酶活性单位[20];CAT活性采用紫外吸收法，测定OD240值，以1 min内下降0.1为一个酶活性单位[21]。

1.3.2SOD、POD和CAT基因表达量分析 采用Real-time PCR的方法，使用qPCR试剂盒SYBR Select Master Mix (ABI)，利用LightCycler 480Ⅱ仪器(Roche公司)测定SOD、POD和CAT基因相对表达量，内参为α-tublin，基因相对表达量计算方法为2-ΔΔCt分析法。总RNA提取采用TRIzol试剂盒(TaKaRa公司)，反转录采用试剂盒Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)。引物由上海生物工程有限公司合成，序列信息[22-23]见表1。

表1 Real-time PCR 引物信息Tab.1 Real-time PCR primers information

1.3.3 温度及CO2浓度测定 采用ZDR-20智能温湿度记录仪和EN-308红外气体分析仪分别进行温室内温度和CO2浓度测定。从施放CO2开始，选择晴天连续测定8：00-18：00温室内的温度和CO2浓度，每隔1 h 测定1次。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010进行图表绘制，用SAS 9.0 软件对试验数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理间温度和CO2浓度的日变化

测定各处理间环境的温度显示，常温处理8：00-18：00时的温度处于25～35 ℃，11：00时达到最大值；高温处理的温度变化为25～45 ℃，10：00时到达处理要求40 ℃并继续升温，这种40 ℃以上的高温状态一直持续到15：00时，每天能够维持4 h以上(图1)。CO2浓度测定结果显示，8：00-18：00时常温和高温处理的CO2浓度保持在360～410 μmol/L，而高温+ CO2处理的CO2浓度从9：00时开始迅速增加，浓度达到1 350 μmol/L，之后有所降低，从9：00-18：00时能够维持CO2浓度在1 000 μmol/L以上(图2)。

图1 不同处理温室内8：00-18：00温度变化Fig.1 The change of temperature in greenhouse under different treatments

图2 不同处理温室内8：00-18：00 CO2浓度变化Fig.2 The change of CO2 concentration in greenhouse under different treatments

2.2 不同取样时间温室内温度和CO2浓度

取样时测定各处理小区内温室环境的温度，结果显示在7～42 d 11：00 时高温和高温+CO2处理的温室温度均为40～45 ℃，而常温处理的温度为35～40 ℃，高温和高温+CO2处理比常温处理平均高5～10 ℃(图3)。CO2浓度测定结果显示，高温+CO2处理小区内CO2浓度较大，达到1 000～1 400 μmol/L，而高温和常温处理中，CO2浓度没有差异，均为300～400 μmol/L(图4)。

图3 不同取样时间温室内温度Fig.3 The temperature of greenhouse in different time

图4 不同取样时间温室内CO2浓度Fig.4 The CO2 concentration of greenhouse in different time

2.3 不同处理对黄瓜叶片SOD活性和基因相对表达量的影响

测定黄瓜叶片SOD活性结果显示，高温处理中黄瓜的SOD活性随着处理时间增加呈现降低的趋势；相反，高温+CO2处理SOD的活性却呈现增加趋势。高温处理中黄瓜的SOD活性在处理7 d时虽然高于常温处理，但是没有显著差异；在处理35，42 d时显著低于常温处理，分别降低了9.7%和16.3%。高温+ CO2处理中，在处理28，35，42 d时SOD的活性显著高于常温处理，分别增加了18.9%，12.3%和19.1%(图5)。分析SOD基因相对表达量结果显示，高温处理的SOD基因相对表达量随着处理时间逐渐降低，处理7，35 d时高温处理的SOD基因的相对表达量显著高于常温处理，分别增加了44.3%和27.5%；高温处理42 d时SOD基因的相对表达量显著低于常温处理，降低了18.5%。但是，高温+ CO2处理中，黄瓜SOD基因相对表达量随着处理时间增加呈现先增加后减少的趋势，在处理28，35，42 d时SOD基因的相对表达量均显著高于常温处理，分别增加了60.7%，36.9%和25.5%(图6)。说明高温条件下，CO2处理增加了黄瓜SOD的活性和基因相对表达量。

不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。图6-10同。 Different letters indicate significant difference(P < 0.05).The same as Fig.6-10.

图6 不同处理对黄瓜叶片SOD基因相对表达量的影响Fig.6 The effect on cucumber SOD gene relative expression in different treatments

2.4 不同处理对黄瓜叶片POD活性和基因相对表达量的影响

测定黄瓜叶片POD活性结果显示，高温处理中黄瓜的POD活性随着处理时间增加呈现降低的趋势；而高温+CO2处理中POD的活性却呈现先增加后降低的趋势。高温处理中黄瓜的POD活性在处理7，14，21 d时显著高于常温处理，分别增加了18.8%，25.1%和24.6%；在处理35，42 d时POD活性显著低于常温处理，分别降低了17.4%和20.2%。而高温+CO2处理中，在处理的各个时间内黄瓜的POD活性均显著高于常温处理，其中在处理28 d时POD活性达到最大值，比常温处理增加了50.4%(图7)。分析POD基因相对表达量显示，高温处理中黄瓜的POD基因相对表达量整体呈现先增加后降低的趋势，在处理7，14，21 d时POD基因的相对表达量显著高于常温处理，分别增加了50.5%，45.2%和27.4%；处理35，42 d时POD基因的相对表达量显著低于常温处理，分别降低了23.2%和24.7%。高温+CO2处理中，黄瓜的POD基因的相对表达量在处理各个时间内均显著高于常温处理，在处理28 d时达到最大值，比常温处理增加了70.3%(图8)。说明高温条件下，CO2处理增加了黄瓜POD的活性和基因相对表达量。

图7 不同处理对黄瓜叶片POD活性的影响Fig.7 The effect on cucumber POD activity in different treatments

图8 不同处理对黄瓜叶片POD基因相对表达量的影响Fig.8 The effect on cucumber POD gene relative expression in different treatments

2.5 不同处理对黄瓜叶片CAT活性和基因相对表达量的影响

测定黄瓜叶片CAT活性结果显示，高温处理中，黄瓜的CAT活性随着处理时间增加呈现降低的趋势，在处理7 d时显著高于常温处理，增加了24.9%；而在处理28，35，42 d时却显著低于常温处理，分别降低了32.3%，31.1%和22.5%。但是，高温+CO2处理中，黄瓜的CAT活性在处理各时间内均显著高于常温处理，在处理21，35 d时达到峰值，分别比常温处理增加了45.0%和37.9%(图9)。分析CAT基因相对表达量发现，高温处理中黄瓜的CAT基因相对表达量呈现降低的趋势，在处理7 d时显著高于常温处理，CAT基因相对表达量增加了48.5%；而在处理21，28，35 d却显著低于常温处理，分别降低了18.7%，22.1%和37.5%。高温+CO2处理中，黄瓜CAT基因相对表达量在处理各时间内均显著高于常温处理，在处理21 d时达到最大值，比常温处理增加了44.9%(图10)。说明高温条件下，CO2处理增加了黄瓜CAT的活性和基因相对表达量。

图9 不同处理对黄瓜叶片CAT活性的影响Fig.9 The effect on cucumber CAT activity in different treatments

图10 不同处理对黄瓜叶片CAT基因相对表达量的影响Fig.10 The effect on cucumber CAT gene relative expression in different treatments

3 讨论

对比取样时3个小区内的温度和CO2浓度发现，高温处理中温度比常温处理高5～10 ℃，但是CO2浓度却没有显著差异；而高温+CO2处理，温度和CO2浓度均高于常温处理。由于高温处理中温度比较高，在处理初期短暂的高温胁迫，诱导了黄瓜SOD、POD和CAT的活性和其基因表达水平，但是随着时间延长，高温胁迫导致植物细胞损伤，因此，在高温处理后期出现SOD、POD和CAT的活性和其基因表达量下降的趋势[3,5]；与高温处理不同，在高温+CO2处理的各个时间内，黄瓜的SOD、POD和CAT的活性和其基因表达量均高于常温处理，并且呈现增加的趋势，说明高温环境下，CO2的施加能够增加黄瓜对于高温的耐受性。因此，我们在夏季生产温室黄瓜，需要在高温条件下加入足够的CO2，这样才能提高黄瓜对高温的耐受性，从而在生产中提高产量。

高温胁迫中，植物细胞内活性氧自由基大量积累，加剧了膜质的过氧化程度，导致细胞膜系统损伤甚至死亡[3,5]。植物中的抗氧化酶(SOD、POD 和CAT等)能够有效的清除活性氧自由基，保护细胞免受自由基伤害，因此，抗氧化酶活性的强弱常被认为是衡量植物耐热性的重要指标[24-26]。茄子中SOD、POD和CAT活性的增加，提高了茄子的耐热性[14]。甜瓜中抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的增加，降低了细胞内丙二醛 (MDA)的含量，有效缓解高温胁迫对甜瓜细胞的过氧化伤害[27]。黄瓜中研究证明，高温处理中，耐热品种的抗氧化酶活性要高于不耐热品种[3]。本研究发现，高温处理降低了黄瓜的抗氧化酶SOD、POD和CAT活性，而高温+CO2处理，SOD、POD和CAT活性却增加。说明高温条件下，CO2的施加能够提高黄瓜植株的耐热性。另外，高温+CO2处理中，黄瓜的POD和CAT活性在处理各时间内均显著高于常温处理，而SOD活性只在处理28 d后才显著高于常温处理，并且活性只增加了18.9%，说明SOD、POD和CAT活性对于CO2的敏感度存在差异，POD和CAT活性对CO2处理较为敏感。

SOD、POD和CAT基因表达量研究表明，随着时间的增加，高温处理降低了黄瓜SOD、POD和CAT基因的相对表达量，而高温+CO2却增加了SOD、POD和CAT基因的相对表达量。这与抗氧化酶SOD、POD和CAT活性变化趋势是一致的。由于已经证明植物对干旱、盐、冷和氧化等逆境胁迫的耐受能力增加，常伴随抗氧化酶(SOD、POD和CAT)的基因表达量上升[21-22,28]。说明高温条件下，CO2处理增加黄瓜耐热能力，主要是通过增加SOD、POD和CAT基因相对表达量进而提高其酶活性来实现的。但是，SOD、POD和CAT活性与基因相对表达量之间还存在不同的变化趋势，高温+CO2处理中，黄瓜的SOD活性在处理7 d时呈现降低趋势，而其基因相对表达量却呈现增加的趋势，说明在CO2处理过程中，SOD活性可能受到其他基因的调控[29]；POD活性在处理35，42 d时呈现降低的趋势，但是其基因相对表达量却没有明显变化，说明在CO2处理过程中，POD可能是转录后调控[30]。

[1] 曹庆杰，孙 权，李建设，等. 不同施氮量对设施黄瓜生长及产量的影响[J]. 北方园艺，2010(8)：1-4.

[2] Xu L，Li Z. Physiological and biochemical responses of cucumber (CucumissativusL.) under prolonged high temperature[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，2009，30(9)：1238-1245.

[3] 田 婧，郭世荣. 黄瓜的高温胁迫伤害及其耐热性研究进展[J]. 中国蔬菜，2012，1(18)：43-52.

[4] 刘少华，陈国祥，胡 艳，等. 高产杂交稻“两优培九”功能叶抗氧化系统对水分胁迫的响应[J]. 作物学报，2004，30(12)：1244-1249.

[5] 李建建，郁继华，常雅君，等. 高温胁迫对黄瓜幼苗叶片质膜透性及保护酶活性的影响[J]. 长江蔬菜，2007，7(9)：59-61.

[6] Matysik J，Alia B B，Mohanty P. Molecular mechanisms of quenching of reactive oxygen species by proline under stress in plant [J] .Curr Sci，2002，82(5)：525-532.

[7] 苏维埃. 植物对温度逆境的适应[M]//余叔文，汤章城. 植物生理与分子生物学.上海：科学出版社，1998：727.

[8] Blum A，Ebercon A. Cell membrane stability as a measure of drought and heat tolerance in wheat[J]. Crop Sci，1981,21：43-47.

[9] 刘瑞芳，杨 健，乌日娜，等. 有限灌溉对马铃薯生理特性的影响[J]. 北方农业学报，2016，44(2)：13-17.

[10] 何晓明，林毓娥，陈清华，等. 高温对黄瓜幼苗生长、脯氨酸含量及SOD酶活性的影响[J]. 上海交通大学学报：农业科学版，2002，20(1)：30-33.

[11] 朱 静，杨再强，李永秀，等. 高温胁迫对设施番茄和黄瓜光合特性及抗氧化酶活性的影响[J]. 北方园艺，2012(1)：63-68.

[12] 张晓晶，鹿 捷，郑永美，等. 高温胁迫对不同花生品种生理指标的影响[J]. 花生学报，2015，44(2)：18-23.

[13] 刘凯歌，宋云鹏，龚繁荣，等. 高温胁迫对甜椒幼苗生长和生理生化指标的影响[J]. 上海农业学报，2015，31(3)：63-67.

[14] 李慧霞. 高温CO2加富条件下温室茄子对高温胁迫的应答反应[D]. 呼和浩特：内蒙古农业大学，2010.

[15] 刘忠国. 高温胁迫对黄瓜幼苗耐热性的研究[D]. 泰安：山东农业大学，2010.

[16] 马 博，崔世茂，张之为，等. 高温CO2加富对温室嫁接黄瓜形态特征净光合速率和Rubisco羧化酶活性的影响[J]. 内蒙古农业大学学报，2013，3(34)：32-39.

[17] 潘 璐，刘杰才，李晓静，等. 高温和加富CO2温室中黄瓜Rubisco活化酶与光合作用的关系[J]. 园艺学报，2014，41(8)：1591-1600.

[18] 刘金泉，王灵茂，尹 春，等. 高温、高湿及CO2施肥条件下黄瓜光合性能的变化[J]. 安徽农业科学，2009，37(6)：2362-2364，2375.

[19] 高 宇，崔世茂，宋 阳，等. CO2加富对不同砧木嫁接黄瓜幼苗生长及光合特性的影响[J]. 北方农业学报，2017，45(1)：92-97.

[20] 张志良. 植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，1990.

[21] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[22] Zhang H J，Zhang N，Yang R C，et al. Melatonin promotes seed germination under high salinity by regulating antioxidant systems，ABA and GA4interaction in cucumber (CucumissativusL.) [J]. Pineal Res，2014，57(3)：269-279.

[23] 高俊杰，秦爱国，于贤昌. 低温胁迫下嫁接对黄瓜叶片SOD和CAT基因表达与活性变化的影响[J]. 应用生态学报，2009，20(1)：213-217.

[24] 吴俊华，侯雷平，李梅兰. 蔬菜高温逆境研究进展[J]. 北方园艺，2006(1)：50-51.

[25] 陈少裕. 膜脂过氧化与植物逆境胁迫[J]. 植物学通报，1989，6(4)：211-217.

[25] 刘书仁，郭世荣，孙 锦，等. 脯氨酸对高温胁迫下黄瓜幼苗活性氧代谢和渗调物质含量的影响[J]. 西北农业学报，2010，19(4)：127-131.

[27] 张永平，杨少军，陈幼源.2,4-表油菜素内酯对高温胁迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性和光合作用的影响[J]. 西北植物学报，2011，31(7)：1347-1354.

[28] Negi N P,Shrivastava D C,Sharma V,et al. Overexpression of CuZnSOD fromArachishypogaeaalleviates salinity and drought stress in tobacco[J]. Plant Cell Req,2015，34(7)：1109-1126.

[29] 肖国增，滕 珂，李林洁，等. 盐胁迫下匍匐翦股颖抗氧化酶活性及基因表达机制研究[J]. 草业学报，2016，25(9)：74-82.

[30] 高俊杰，张 琳，秦爱国，等. 氯化钠胁迫下嫁接黄瓜叶片SOD和CAT mRNA基因表达及其活性[J]. 应用生态学报，2008，19(8)：1754-1758.

Effect of CO2on Cucumber Leaf SOD，POD and CAT Activity and Gene Expression under High Temperature

ZHANG Zhiwei，LI Xiaojing，BAI Jinrui，CHEN Shuai，FAN Mengxuan

(College of Agronomy，Inner Mongolia Agriculture University，Huhhot 010019，China)

In order to explore the effect of CO2on SOD, POD and CAT activity and their gene expressions under high temperature, the grafting cucumber in greenhouse was used as material, trying to study the changes of cucumber leaf SOD, POD and CAT activity and gene expression under high temperature after treating with CO2.The results showed SOD，POD and CAT activity in cucumber leaf were increased after treating with CO2under high temperature. Comparing with room temperature treatment，the max difference of cucumber SOD，POD and CAT activity were at 42，28 and 21 days after treating with CO2and high temperature，and increased by 19.1%，50.4% and 45.0% respectively. Using Real-time PCR analysis cucumberSOD，PODandCATgene expression were all increased after treating with CO2under high temperature. The max difference of cucumberSOD，PODandCATgene expression level were at 28，28 and 21 days after treating with CO2and high temperature，and with 60.7%，70.3% and 44.9% higher than room temperature treatment respectively. In conclusion，after treating with CO2，the cucumber SOD，POD and CAT activity and their gene expression level were both increased under high temperature.

Cucumber；High temperature；CO2；Antioxidase；Gene expression

2017-06-23

内蒙古教育厅项目(NJZY14083)；内蒙古自然科学基金项目(2015BS0313)

张之为(1982-)，男，内蒙古巴彦淖尔人，副教授，博士，主要从事植物生理研究。

S642.2

A

1000-7091(2017)04-0067-06

10.7668/hbnxb.2017.04.011