中国水仙凝集素基因在大花烟草中的定量表达及抗蚜性分析

杨会苗，陈段芬

(河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001)

中国水仙凝集素基因在大花烟草中的定量表达及抗蚜性分析

杨会苗，陈段芬

(河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001)

为了确定中国水仙凝集素基因NTL1的抗蚜功能及培育具有抗蚜功能的大花烟草，利用qPCR方法，研究了中国水仙凝集素基因(NTL1)在转基因大花烟草4个株系中的相对表达情况；利用自然感蚜、活体接种和离体接种方法研究了不同转基因株系的抗蚜能力。结果表明，NTL1在不同株系中的相对表达量差异显著，从高到低依次为3，4，1，2；抗蚜虫试验结果显示：转基因烟草具有一定抗蚜性，但不同烟草株系的抗蚜能力有所不同；活体转基因烟草单株与离体烟草叶片的平均蚜虫密度抑制率分别为8.22%～76.61%，4.62%～65.65%；转基因大花烟草可加速蚜虫的死亡。对比NTL1在不同转基因大花烟草株系中的相对表达量及抗蚜效果，发现NTL1在不同株系中的相对表达量与植株抗蚜性具有高度一致性。

中国水仙；凝集素基因；qPCR；大花烟草；抗蚜性

植物凝集素(Lectin)是由Stillmark于1888年从蓖麻(RicinuscommunisL.)籽中获得的一种可以可逆结合特异单糖或寡糖并具有凝血活性的蛋白，之后在多种植物的种子、根、茎、叶、果实、子房中均发现有植物凝集素的广泛存在[1]。对其功能研究发现，植物凝集素具有一定的抗虫能力[2-4]，尤其对鳞翅目[5-7]、同翅目蚜虫[7-17]、褐飞虱[18-19]、叶蝉[20]等刺吸式口器害虫具有一定抗性。

蚜虫作为一种重要的害虫，通过吸食营养、影响光合和传播病毒三方面危害植物[21]。由于蚜虫具有种类多、世代周期短、繁殖速度快、寄主范围广等特点，防治难度甚大。当前防治蚜虫的方法主要为化学药剂防治、生物防治、选育抗蚜品种等[22-23]，但化学药剂的大量使用对生态环境造成巨大破坏，生物防治无法广泛应用于农业生产，选育抗蚜品种则费时费力。

随着转基因技术的发展，植物凝集素广泛应用于植物的抗虫育种。目前，已发现的具有抗虫功效的凝集素基因有麦胚凝集素、豌豆凝集素、雪花莲凝集素、苋菜凝集素、半夏外源凝集素等。其中，雪花莲凝集素对蚜虫具有强烈的毒性[12-13,24-28]。中国水仙凝集素基因NTL1是从中国水仙金盏银台中克隆到的一个凝集素基因，该基因编码的前体蛋白的一级结构与雪花莲凝集素的一致性达81%，且三级结构极其相似[29]。而对于该基因的抗虫功能，尚未有人对其进行研究。本研究通过对转入中国水仙凝集素基因NTL1的大花烟草进行qPCR表达分析，同时对转基因植株进行抗蚜虫试验，一方面分析该基因的抗蚜虫性能，另一方面为今后抗蚜大花烟草新品种的选育提供借鉴和参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

携带NTL1基因的大花烟草(Nicotianaalata)T0植株由河北农业大学园艺实验室保存。烟蚜(Myzuspersicae)由山东农业大学惠赠。

1.2 试验方法

1.2.1 T0转基因大花烟草不同单株的qPCR表达分析 选取4个转基因大花烟草的不同单株和对照植株，提取总RNA，用HiFi-MMLVcDNA第1链合成试剂盒反转录合成的cDNA为模板，在NTL1基因的特异性区域设计引物(上、下游引物见表1)，以烟草β-actin为内参基因(表1)，对NTL1基因进行qPCR扩增，采用2-ΔΔCT法进行数据的相对定量分析。

表1 qPCR引物Tab.1 Primers for qPCR

1.2.2 T0转基因大花烟草不同株系自然感蚜性鉴定 不同株系自然感蚜性鉴定参照蚜量比值法[30]。以徐雪莲等[31]抗蚜方法为参照并加以改进。选取同期栽植长势一致的转基因植株，以非转基因植株为对照株，搭建塑料小棚，将转化植株放于塑料小棚中，同时放入已感蚜植株，调查各个植株的自然感蚜情况(图1-A)。感蚜性标准以平均单株蚜量比值大小进行分级：0～0.25(高抗HR)、0.26～0.50(抗蚜R)、0.51～0.90(中抗MR)、0.91～1.25(感蚜S)、大于1.25(高感HS)。平均单株蚜量比值= 平均单株蚜量/ 所有参试植株平均单株蚜量。

1.2.3 T0转基因大花烟草不同株系蚜虫密度抑制试验 选取长势一致的转基因植株与非转基因植株，每株接虫5只，烟草幼苗外部遮盖孔径为0.150 mm防虫网，重复5次。将烟草苗移到人工气候室进行培养(图1-B)。培养条件为：湿度80%，温度22 ℃，光照∶黑暗=14 h∶10 h。每天上午9：00调查蚜虫数量，共调查14 d。

抗蚜效果评价标准[8]：

蚜虫密度抑制率=(对照植株虫数-参试植株虫数)/对照植株虫数×100%；

平均蚜口密度抑制率=各个参试植株的蚜虫密度抑制率之和/参试植株数×100%。

1.2.4 T0转基因大花烟草不同株系离体叶片蚜虫密度抑制试验 培养皿底部铺2层无菌水浸湿的滤纸，每皿中放置1枚状态一致的叶片，叶柄处用浸水脱脂棉进行包裹。用毛笔向烟草叶片上接蚜虫5只，重复5次。将培养皿移到人工气候室进行培养，培养条件同1.2.3(图1-C)。每天调查蚜虫生长状况，共调查14 d。抗蚜效果评价标准参照1.2.3。

1.2.5 生殖能力调查 方法及培养条件同1.2.4，但每个叶片接蚜虫一只，重复5次。每天观察母体蚜虫的存活状况及幼蚜的生殖情况，并挑出新生蚜虫，直至母体蚜虫死亡为止(图1-D)。

A.感蚜性试验；B.转基因植株抗蚜试验；C.离体叶片蚜量测定；D.离体叶片蚜虫生殖能力测定。

A. Test of aphid susceptibility; B. Aphid bioassay of transgenic tobacco plant; C.Determination of aphid quantity on the detached leaf; D.Determination of aphid fecundity on the detached leaf .

图1 转基因烟草抗蚜试验
Fig.1 Aphid bioassay of transgenic tobacco

2 结果与分析

2.1 T0转基因大花烟草不同单株的qPCR表达分析

2.1.1 中国水仙凝集素基因NTL1引物筛选 选取烟草cDNA配置成5，52，53，54，55倍5个梯度稀释，稀释后取2 μL作模板，用NTL1基因引物进行扩增，同时在60～95 ℃进行融解曲线分析，仪器自动绘制出基因标准曲线。从图2可见，NTL1基因标准曲线的R2达到0.99，说明线性相关度很高，且扩增效率均在90%以上，溶解曲线只有明显的单一峰，因此，可采用此种方法和上述引物进行后续样本的扩增分析。

图2 NTL1基因标准曲线及溶解曲线Fig.2 Standard curve and melt curve for NTL1

2.1.2 不同单株的qPCR表达分析 将各样品cDNA 10倍稀释，取2 μL作模板，分别用目的基因NTL1引物和内参基因β-actin引物进行扩增。同时在60～95 ℃进行溶解曲线分析。结果发现：NTL1基因与大花烟草内参基因β-actin的溶解曲线均只有一个明显单峰，说明所用引物是正确的，能够特异性地扩增各个基因的相应产物，没有形成引物二聚体等其他产物，且每个样品的 PCR 扩增曲线正常，整体平行性和重复性较好，由此可推断试验数据是准确可靠的(图3，4)。

图3 目的基因NTL1的扩增曲线(左)和溶解曲线(右)Fig.3 Amplification curve (left) and melt curve (right) of NTL1

图4 内参基因的扩增曲线(左)和溶解曲线(右)Fig.4 Amplification curve (left) and melt curve (right) for reference gene

根据qPCR原始检测结果，按照2-ΔΔCT相对定量计算公式，计算出各样品中目的基因的相对定量结果。结果显示：中国水仙凝集素基因NTL1在4个转基因植株单株中均有表达，但表达量不同，3>4>1>2(图5)。

a、b、c、d.在0.05水平上显著。图6-8同。a,b,c,d.Correlation is significant at the 0.05 level.The same as Fig.6-8.

2.2 T0转基因大花烟草抗蚜试验

2.2.1 自然感蚜试验 自然感蚜试验表明，接种蚜虫第7，14天对照株植株上的蚜虫数量多于转化植株；第21，28天1号植株上的蚜虫数量最多，其次为对照株，2，3，4号相对较少；各处理大花烟草植株上的蚜虫数量均表现相同的规律，即随时间的发展呈现先增多后减少的趋势(图6)。

不同大花烟草植株的抗蚜性结果显示(表2)：第7，14，21，28天的对照株蚜量比值分别为2.21，1.73，1.65，1.74，均大于1.25，属于高感株。第7天时，转基因植株蚜量比值分别为0.77，0.19，0.87，0.96，对蚜虫的抗性表现为中抗、高抗、中抗和感蚜。随时间推进，1号植株蚜量比值增大，分别为1.38，1.80，1.87，均大于1.25，对蚜虫的抗性表现为高感；2号植株蚜量比值增大，分别为0.42，0.45，0.45，对蚜虫抗性表现为抗蚜；3号蚜量比值分别为0.56，0.23，0.56，对蚜虫的抗性表现分别为中抗、高抗、中抗。4号烟草蚜量比值为0.91，0.87，0.37，对蚜虫的抗性表现为感蚜、中抗、抗蚜。

图6 不同烟草植株蚜量比较Fig.6 Comparison of aphid amount on tobacco plants

调查日期 Time 蚜量比值ThenumberratioofaphidCK1234接蚜后7d7daysafterinoculateaphid2.210.770.190.870.96接蚜后14d14daysafterinoculateaphid1.731.380.420.560.91接蚜后21d21daysafterinoculateaphid1.651.800.450.230.87接蚜后28d28daysafterinoculateaphid1.741.870.450.560.37

2.2.2 转基因大花烟草的抗蚜虫试验 将试验植株和对照植株转接蚜虫后，每天观察烟草上蚜虫的分布情况及群体的繁殖情况(图1-B)。结果显示，接种蚜虫初期即第1，2天时，各个转基因烟草植株上的蚜虫量与对照相比差异不明显；对照株、1，2号株系随接种时间的延长，单株上的蚜虫量逐渐增多，在第7天前增长缓慢，后期增长迅速，第14天时蚜量达到最大值；3号与4号株系上的蚜量随接种时间的变化并不大(图7-A)。接种后期即12～14 d时对比各个株系上的蚜虫，1，3，4号烟草株系低于对照株，2号植株与对照相差不大。

图7 不同转基因烟草植株的蚜虫总量与蚜虫密度抑制率Fig.7 The gross and the rate inhibition of aphids on different transgenic tobacco

转基因烟草植株对蚜虫的抑制率如图7-B右所示。结果显示：不同植株在不同时期的蚜虫抑制率不同。接种初期，转基因植株与对照株对蚜虫的抑制效果差异不显著，随时间的推进抑制率有所变化，接种后期，1，3，4号植株表现一定的抑制效果。试验植株的平均蚜虫抑制率为8.22%～76.61%。对比蚜虫量及蚜虫抑制率结果发现：转基因大花烟草株系具有一定抗虫效果。

2.2.3 转基因大花烟草离体叶片抗虫试验 将试验与对照烟草的叶片上分别转接5只蚜虫后，每天调查蚜虫生长状况及繁殖情况，连续调查14 d(图1-C)。图8-A为连续14 d各个烟草叶片每天的蚜虫量。对各个烟草叶片进行对比发现：接种后的第1～5天，各个烟草叶片上的蚜虫量差异不明显；从第6天开始，植株叶片上的蚜虫量开始明显增加，到第14天观察结束时数量达到最大。其中，2，3，4号烟草叶片的蚜虫量低于对照，1号与对照相差不大。

图8 不同转基因烟草叶片上的蚜虫总量与蚜虫密度抑制率Fig.8 The gross and the rate inhibition of aphid on different transgenic tobacco

统计发现(图8-B)，转基因烟草的蚜虫抑制率明显高于对照，但蚜虫密度抑制率因接种的时间与叶片的不同而有所不同，平均蚜虫密度抑制率集中于4.62%～65.65%。综合蚜量与蚜虫抑制率结果发现，2，3，4号株系对蚜虫具有一定的抗蚜效果。

2.2.4转基因大花烟草离体叶片对蚜虫生殖力影响 离体叶片对蚜虫生殖力影响试验结果如表3和图9所示。由表3可看出，不同转基因烟草叶片上的母体蚜虫开始产蚜的日期与非转基因烟草相差不大，均在接种蚜虫的第1，2天就开始产生幼蚜；而母体蚜虫死亡时间有所差异，对照植株平均于17 d时母体蚜虫死亡，转基因烟草上的蚜虫死亡平均时间早于对照，分别于接虫后7，14，7，8 d母蚜死亡。

转基因烟草对于母体蚜虫生产的幼蚜数量有一定影响，图9为不同转基因烟草叶片上的母体蚜虫产生的幼蚜总数。结果表明，1，3，4号转基因大花烟草的幼蚜量显著少于对照株。

表3 转基因烟草对蚜虫生殖能力的影响Tab.3 The effect of transgenic tobacco on fecundity of aphid

图9 不同转基因烟草叶片上母蚜生产的幼蚜数量Fig.9 Number of larva aphid produced from maternal aphids

3 结论与讨论

本试验将转入中国水仙凝集素基因NTL1的大花烟草进行了qPCR分析。qPCR结果表明，NTL1基因在不同转基因大花烟草株系中的相对表达量不同，由高到低分别为3，4，1，2号株系。

抗蚜性试验主要从自然感蚜性、蚜虫抑制率、生殖能力三方面进行测试。

自然感蚜试验通过蚜量比值法对抗蚜性进行分级，分级结果表明，非转基因大花烟草植株属于高感株；转基因大花烟草株系表现一定的抗蚜性，但抗性效果有所不同，1号前期表现为中抗，后期表现为感蚜；2号株系由高抗变为抗蚜；3号株系主要表现为中抗；4号株系由感蚜变为抗蚜。

蚜虫抑制率试验结果显示，转基因大花烟草的蚜虫总量明显低于对照，各转基因株系的平均蚜虫密度抑制率为8.22%～76.61%。说明外源基因的介入提高了植株对蚜虫的抗性。

生殖能力测试结果显示，对照植株上母体蚜虫生产的幼蚜数最多，其次为2，4，1，3号株系；对照株系上母体蚜虫生存天数长于转基因株系的母蚜生存天数，这与张晓英等[8]发现转雪花莲凝集素国槐加速母蚜死亡的研究结果一致。

离体叶片试验不仅对蚜虫的生殖能力进行测定，还对蚜虫的增殖情况进行测定，结果显示：1号株系与对照株系的蚜虫量增加明显，二者差异并不显著，2，3，4号株系蚜虫增殖较少，且明显少于对照植株，平均蚜虫密度抑制率为4.62%～65.65%，说明转基因大花烟草株系对蚜虫具有一定的抑制效应。王关林等[25]研究发现，转雪花莲凝集素基因(GNA)不同菊花株系蚜口密度抑制率为10%～84%；Hilder等[9]研究发现，转GNA烟草的平均蚜虫密度抑制率为50%。高泽发等[26]研究发现，转GNA的小麦的平均蚜虫密度抑制率约为47%；张晓英等[8]研究发现，转GNA的不同国槐植株具有明显的抗蚜性，平均蚜口密度抑制率为30.3%；周岩等[28]研究发现，转GNA的烟草对桃蚜具有较强的抗蚜能力，平均密度抑制率达到45%～60%。由此可见，中国水仙凝集素基因NTL1与GNA具有相似的抗蚜性，是一个值得继续研究的新型抗蚜基因。

通过比较本试验中NTL1在不同转基因大花烟草株系中的相对表达量及其抗蚜效果，结果发现，不同转基因大花烟草的抗蚜性与NTL1在不同株系中的表达结果是高度一致的，即表达量高的植株抗虫效果明显，而表达量低的植株抗虫效果较差。

离体叶片的抗虫试验结果略有不同，原因可能是由于在离体试验中蚜虫的增殖不仅受供试烟草的影响，还有可能受到试验空间及中途换叶等人为因素的影响。因此，有必要探索更为精确的试验方法，继续研究该基因在其他植物材料上的抗蚜效果。

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Analysis of qPCR and Resistance to Aphid ofNTL1 Gene fromNarcissustazettavar.chinensisinNicotianaalata

YANG Huimiao,CHEN Duanfen

(College of Horticulture，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China)

The expression of the lectin gene (NTL1) fromNarcissustazzettavar.chinensisinNicotianaalatawas studied by qPCR method in order to determine the aphid-resistant function ofNTL1 and cultivateN.alatawith aphid-resistant. By means of susceptible to aphid，inoculationinvivoandinvitro，the resistance to aphid in different transgenic tobacco was studied. The result showed thatNTL1 gene had been integrated into the tobacco，but the expression of different tobacco was different，the expression ofNTL1 in tobacco by descending order was 3,4,1,2. The bioassay of aphid indicated that transgenic tobacco had a certain resistance to aphid，but the capacity of aphid-resistance in different tobacco plant was slightly different；The average density inhibition rate of aphid in inoculationinvivoandinvitrowas 8.22%-76.61% and 4.62%-65.65%. The transgenic tobacco could speed up the aphid′s death. The relative expression ofNTL1 gene in different transgenic tobacco and the result of resistance to aphid were compared，showed that two results came with a high degree of consistency.

Narcissustazettavar .chinensis；Lectin gene；qPCR；Nicotianaalata；Resistance to aphid

2017-06-12

河北省自然科学基金项目(C2014204131)

杨会苗(1990-)，女，河北柏乡人，在读硕士，主要从事观赏植物种质资源与创新研究。

陈段芬(1968-)，女，河北宁晋人，教授，博士，主要从事观赏植物种质创新利用研究。

S433.1

A

1000-7091(2017)04-0078-07

10.7668/hbnxb.2017.04.013