干旱胁迫对蒲公英渗透调节物质、酶保护系统及质膜水孔蛋白PIP2-3基因表达的影响

王一鸣，汪 湖，龙胜举，赵英鹏，陈 延，贺忠群

(四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130)

干旱胁迫对蒲公英渗透调节物质、酶保护系统及质膜水孔蛋白PIP2-3基因表达的影响

王一鸣，汪 湖，龙胜举，赵英鹏，陈 延，贺忠群

(四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130)

为了揭示蒲公英在干旱胁迫下渗透调节和酶保护系统的作用机理以及质膜水孔蛋白PIP2-3基因的表达特征，采用盆栽控水试验，研究了不同干旱胁迫(RWC=(90±5)%、RWC=(75±5)%、RWC=(50±5)%下蒲公英渗透调节物质、酶保护系统以及质膜水孔蛋白基因的相关表达。结果表明：随着干旱胁迫的加重，蒲公英叶片中的可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸的含量显著增加，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性显著提高，在轻度胁迫(MS)中呈持续上升的趋势，重度胁迫(SS)中则呈现先升高后下降的趋势(可溶性糖除外)；质膜水孔蛋白PIP2-3基因的相对表达量上调，轻度胁迫(MS)显著高于重度胁迫(SS)。复水7 d后，渗透调节物质的积累以及SOD的含量下降，但仍显著高于CK，POD、CAT的含量以及质膜水孔蛋白PIP2-3基因的相对表达量恢复正常，说明在干旱胁迫条件下蒲公英通过增加渗透调节物质的积累，提高酶保护系统的活性来增强植株的抗逆性，上调质膜水孔蛋白基因的相对表达量来加强水分运输能力。

蒲公英；干旱胁迫；渗透调节；酶保护系统；质膜水孔蛋白

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)，又名蒲公草、婆婆丁、尿床草。属菊科，蒲公英属多年生草本植物，叶边缘具有波状齿或羽状深裂[1]。目前临床医学已经证实蒲公英具有抗氧化、抑菌、降血脂、降血糖、保肝利胆、胃黏膜损伤修复等作用[2]。具有十分重要的营养价值和药用价值。

随着全球气候的逐步变暖，干旱已经成为植物生长的限制因素，可造成作物产量的严重下降[3]。在我国，干旱、半干旱地区的面积约占国土面积的52.5%[4]，并呈逐年增加的趋势。植物在遭受干旱胁迫而受到损伤之前，通过调节渗透物质含量，让细胞膨压维持在一个正常的范围内，使细胞内各种代谢过程得以正常进行[5]，同时依靠酶保护系统的响应，降低植株体内自由基的含量，从而减轻活性氧(ROS)对植株的伤害[6]，以此来降低胁迫对植物造成的损伤[7]。

水孔蛋白是原生质膜上的水通道蛋白，可高效转运水分子，属于膜内蛋白MIP家族[8]。有研究表明，拟南芥受到严重干旱胁迫时，AtPIP1对调节花节和根的渗透压起着关键作用[9-10]。而水稻在受到严重干旱胁迫时，其质膜水孔蛋白PIP的表达或者磷酸化水平会下降，以此降低质膜的透水性[11]；但其液泡膜水孔蛋白TIP的表达量却会提高[12]，所以在干旱胁迫下，植物可能通过降低PIP的表达以减少细胞内水分的流失，提高TIP的表达，利用液泡来维持胞质的渗透压平衡[13]。

近年来，野生蔬菜的市场认可度越来越高，像蒲公英这样具有药用和食用功能的野生蔬菜，已经在医学和营养方面引起了广泛的研究。目前，蒲公英在栽培技术、病虫害防治、药用成分提纯等方面都有研究，但在逆境生理方面的研究较少，特别是抗旱研究。因此，研究干旱胁迫下蒲公英的各种生理变化，对于探讨蒲公英的抗旱机制以及在干旱地区的种植都具有一定的参考价值。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用蒲公英种子来自辽阳园艺花卉科学研究所。

1.2 试验方法

采用盆栽试验法，在大棚中进行种植。将蒲公英种子散播在苗床中，等幼苗长出4片真叶时，移栽至以腐叶土∶蛭石∶珍珠岩(2∶1∶1)混合基质的营养钵中(10 cm×10 cm)，基质重量为370 g，每个营养钵中种2株幼苗。长出7片真叶时进行干旱处理，试验设置3个胁迫水平(土壤相对含水量)，分别为对照CK(RWC=(90±5)%)，轻度胁迫MS(RWC=(75±5)%)，重度胁迫SS(RWC=(50±5)%)。每个处理30盆，总共90盆。处理开始前，使每个营养钵中土壤的含水量达到饱和，然后使其自然干旱至各胁迫水平并保持。试验采取称重法测定土壤含水量，每天进行一次。相关生理指标在持续胁迫0，3，6，9 d时进行测定，9 d后从每个处理中取出10盆复水至对照水平，复水7 d再测定相关生理指标。

1.3 测定内容与方法

1.3.1 渗透调节物质 可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定；可溶性糖采用蒽酮法测定；脯氨酸(Pro)含量用酸性茚三酮法测定[14]。

1.3.2 抗氧化酶活性的测定 SOD测定方法参考《植物生理学实验教程》[14]；POD、CAT测定参考孙群等《植物生理学研究技术》[15]。

1.3.3 总RNA的提取及cDNA的合成 将胁迫0，9 d、复水7 d的新鲜叶片用液氮速冻后，使用宝生物工程有限公司的RNAiso Plus试剂盒提取总RNA，使用宝生物工程有限公司的PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行反转录。

1.3.4 水孔蛋白PIP2-3基因的分离与表达分析 根据NCBI中登陆的拟南芥、黄瓜、酿酒葡萄的质膜水孔蛋白参考基因组中PIP2的保守区核苷酸序列设计合成引物[16]，上、下游引物(F：5′-CCATGGCCGCGATCGTCCTG-3′，R：5′-TGATGGTGAGAATCTCGCGG-3′，扩增长度310 bp，Gene ID：818294)。用pMD18-T载体进行链接克隆[17-18]，扩增克隆得到PIP2-3基因的中间片段序列，送擎科生物成都合成部进行测序。

根据测序所得的结果，运用Primer 5.0进行RT-PCR的引物设计(G1F：5′-TTATACAGAGCAGTCATC-3′，G1R：5′-CTGAATCTTGTAACCAATG-3′)，以拟南芥Actinβ(101260631)作为内参基因(ActinβF：5′-GATGGTGTCAGCCACAC-3′，ActinβR：5′-ATTCCAGCAGCTTCCATTCC-3′)，以ddH2O作为空白对照，以不加模板的cDNA作为阴性对照，采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量[19]。

1.4 数据统计分析

用Excel 2016对数据进行统计分析，用SPSS软件采用最小显著差异法(LSD)进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫与复水对可溶性糖的影响

可溶性糖可参与细胞的渗透调节[20]。研究结果表明(图1)，蒲公英在干旱胁迫下，叶片内的可溶性糖含量持续上升，随着胁迫程度的进一步加重，叶片内的可溶性糖含量迅速增加。蒲公英在重度胁迫(SS)下3 d可溶性糖含量显著上升，在第3，6，9天时叶片内的可溶性糖含量比对照CK高75.62%，212.47%，238.88%。轻度胁迫(MS)在3 d以后，叶片内的可溶性糖含量才显著性上升，在第6，9天时叶片内的可溶性糖含量比对照CK高124.02%，167.05%。在复水7 d后，轻度胁迫(MS)条件下蒲公英叶片内可溶性糖含量恢复正常，重度胁迫(SS)下蒲公英叶片内可溶性糖含量虽然显著下降，但依然比对照CK高79.08%，差异达显著水平。

图中不同时间段不同小写字母表示在P< 0.05水平上差异显著。图2-4，6同。 The small-letter of each time means significantly different at the P<0.05 level.The same as Fig.2-4,6.

2.2 干旱胁迫下可溶性蛋白含量的变化

图2表明，随着胁迫的程度以及胁迫时间的增加，蒲公英叶片内可溶性蛋白的含量(以鲜质量计)呈现出先增加后降低的趋势。其中轻度胁迫(MS)在第9天时，叶片内的可溶性蛋白含量达到最大值，与对照CK相比可溶性蛋白含量提高了73.35%。重度胁迫(SS)在第3天时，叶片内的可溶性蛋白含量显著高于CK和轻度胁迫(MS)，在第6天时达到最大值，叶片内的可溶性蛋白含量相比CK提高了111.08%，在第9天时叶片内的可溶性蛋白含量显著下降，并显著低于轻度胁迫(MS)。在复水7 d以后，轻度(MS)和重度胁迫(SS)蒲公英叶片内的可溶性蛋白含量仍显著高于CK 33.83%和84.55%。轻度胁迫(MS)相比于复水前，叶片内的可溶性蛋白含量开始显著降低并接近CK。但重度胁迫(SS)相比于复水前，叶片内的可溶性蛋白含量不降反升，这可能是复水7 d以后，植株依然在对重度胁迫(SS)下造成的损伤进行修复。

2.3 干旱胁迫下游离脯氨酸的变化

由图3可知，随着胁迫时间增加，蒲公英叶片内的游离脯氨酸含量(以鲜质量计)迅速增加。在第3天，轻度(MS)和重度胁迫(SS)蒲公英叶片内的游离脯氨酸含量比CK高58.56%和71.19%，之后轻度胁迫(MS)蒲公英叶片内的游离脯氨酸含量一直增加，在第9天时达到最大值，比对照CK高107%。

重度胁迫(SS)蒲公英叶片内的游离脯氨酸含量在第6天时达到最大值，比对照CK高187.76%，在第9天时开始下降。复水7 d以后，轻度(MS)和重度胁迫(SS)蒲公英叶片内的游离脯氨酸含量开始显著下降，但仍显著于高CK 30.97%和74.02%。

图2 干旱胁迫与复水对可溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effect of drought stress and rewatering on dandelion soluble protein content

图3 干旱胁迫与复水对脯氨酸含量的影响Fig.3 Effect of drought stress and rewatering on dandelion proline content

2.4 干旱胁迫对SOD、POD、CAT的影响

SOD、POD、CAT属于抗氧化酶，在维持活性氧自由基的产生与清除系统的平衡中发挥着重要的作用[21]。研究结果表明(图4)，随着胁迫时间延长以及胁迫程度的加深，蒲公英叶片内的SOD、POD、CAT的含量(以鲜质量计)基本上呈现出先增高后保持在一个较高水平的现象。其中轻度胁迫(MS)蒲公英叶片内SOD含量在第6天显著高于CK，在第9天达到最大值，比CK高67.86%。重度胁迫(SS)蒲公英叶片内SOD的含量在第3天显著高于CK，在第6天达到最大值，比CK高75.34%，然后一直维持在一个较高的水平。

轻度胁迫下(MS)蒲公英叶片内的POD含量上升缓慢，在第9天才显著高于CK，比CK高35.72%。重度胁迫(SS)蒲公英叶片内的POD含量在第3天显著上升，在第6天达到最大值，比CK高59.8%，在第9天其含量显著下降，只比CK高15.63%。

轻度(MS)和重度胁迫(SS)下蒲公英叶片内的CAT含量在第3天便显著高于CK，在第6天达到最大值，叶片内的CAT含量比CK高20.69%和43.45%，然后一直保持在一个较高的含量。

复水7 d后轻度(MS)和重度胁迫(SS)下蒲公英叶片内POD和CAT的含量恢复至正常，轻度胁迫(MS)蒲公英SOD的含量与CK差异不显著，重度胁迫(SS)蒲公英SOD的含量依然显著高于CK 43.38%。

2.5 干旱胁迫对蒲公英PIP2-3基因的诱导表达的影响

根据NCBI中已登录的拟南芥、黄瓜、酿酒葡萄的质膜水孔蛋白参考基因组中PIP2的保守区核苷酸序列设计合成引物，以cDNA为模板，成功克隆出了蒲公英质膜水孔蛋白PIP2-3。测序结果表明蒲公英质膜水孔蛋白PIP2-3的cDNA全长303 bp，将PIP基因序列在NCBI中进行Blast同源性比对，结果显示该序列与已登录的拟南芥、黄瓜、酿酒葡萄的质膜水孔蛋白PIP2-3的同源性为93%，91%，90%(图5)。说明该cDNA序列片段应该是蒲公英质膜水孔蛋白PIP2-3基因的保守区序列。

利用荧光定量PCR技术，对蒲公英质膜水孔蛋白PIP2-3基因在叶片中的相对表达量进行分析。结果表明(图6)，在胁迫刚开始以及复水7 d后，蒲公英叶片内的质膜水孔蛋白基因PIP2-3与对照CK无显著差异，在胁迫9 d时，轻度(MS)和重度胁迫(SS)蒲公英叶片内的质膜水孔蛋白基因的相对表达量比对照CK高37.25%和18.35%。这可能是在重度胁迫(SS)条件下对蒲公英造成了较重的损伤，导致了表达量的下降。

图6 蒲公英PIP2-3基因在干旱胁迫下的表达Fig.6 Dandelion PIP2-3 gene expression under drought stress

3 讨论

随着全球气候变暖，干旱逆境问题日趋严重。干旱、盐碱及冷害这三大非生物胁迫因素，目前已经成为许多作物产量下滑的重要原因[22]，过度的胁迫会导致作物细胞失水，产生水分亏缺，从而对植物的渗透调节造成破坏。可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸作为渗透调节的小分子物质，在维持细胞渗透压，防止原生质过度失水[23]，抵御植物抗逆境生理上发挥着重要作用。邵艳军等[24]认为可溶性糖在植物应对干旱胁迫时参与渗透调节以及复水后生理的修复和恢复过程。可溶性蛋白可以在细胞缺水的情况下起到保水的作用[25]，是植物代谢中蛋白损伤的重要指标，细胞内蛋白质的合成、变性以及降解等信息均可尤其反应[26]。游离脯氨酸作为一种重要的渗透保护剂，在逆境胁迫条件下均会在植物体内大量的积累[27]。试验研究表明，随着胁迫时间的延长以及胁迫程度的加重，蒲公英叶片内的可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸的含量基本呈现出先升高后降低的趋势，且胁迫程度越严重，渗透调节物质增加得越快，在植株叶片内积累得越多，这与吴敏等[28]研究干旱胁迫对栓皮栎幼苗细根的结果一致。在复水7 d后，3种物质的含量虽然显著下降，但在蒲公英叶片内的含量依然较高，这可能与植物还在修复胁迫所遭受的损伤有关。

植物在遭受干旱胁迫时，其体内会产生超氧阴离子自由基等活性氧自由基，对植物造成损伤，而SOD、POD、CAT等抗氧化酶，对维持植物体内活性氧自由基的产生与清除系统的平衡发挥着重要的作用[21]。本试验研究表明，蒲公英在遭受干旱胁迫的过程中SOD、POD、CAT的含量显著上升，随着胁迫时间的延长SOD和CAT保持在一个较高的水平。而POD的含量在重度胁迫(SS)下先上升后下降，这可能与活性氧的产生超过了细胞的清除极限，从而导致了酶保护系统活性的降低有关。复水7 d以后，POD、CAT下降至正常水平，而SOD虽然下降，但其含量仍显著高于CK，这可能与细胞修复过程中持续产生的活性氧有关。

干旱所造成的水分亏缺，可以在植物细胞内引发一系列复杂的响应。植物水孔蛋白在水分运输上发挥着重要的作用[29]。在干旱胁迫下，不同植物之间水孔蛋白的表达具有一定的差异，其在转录水平上的调节与植物不同的组织部位[30]、生长发育的不同阶段[31]以及环境因子有关。有研究表明，在干旱胁迫条件下，烟草的NtPIP1;1和NtPIP2;1的转录水平显著降低，而NtAQP1的转录水平则有一定的升高[32]。而本试验的研究结果显示，在干旱胁迫条件下，蒲公英的质膜水孔蛋白PIP2-3基因的相对表达量上调，且轻度胁迫(MS)要显著于重度胁迫(SS)，这与烟草的试验结果相反。这可能与试验环境即蒲公英可能增加质膜水孔蛋白PIP2-3基因的相对表达量直接从空气中吸收水分以弥补水分的亏缺有关，具体情况还需要进一步研究论证。

综上所述，在干旱胁迫条件下，蒲公英通过增加叶片内渗透调节物质的积累(可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨)，提高酶保护系统的活性，以及上调质膜水孔蛋白PIP2-3基因的相对表达量来提高水分的运输能力以应对干旱胁迫。

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Effects of Drought Stress on Osmoregulation Substances，Enzyme Protection System and Expression of Plasma Membrane Hole Protein GenePIP2-3 inTaraxacummongolicumHand.-Mazz.

WANG Yiming，WANG Hu，LONG Shengju，ZHAO Yingpeng,CHEN Yan,HE Zhongqun

(College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130,China)

In order to reveal the mechanism of osmotic adjustment and enzyme protection system of dandelion and gene expression characteristics of plasma membrane aquaporinPIP2-3 under drought stress.Using pot water control experiments to study the effects of soil drought stress(RWC=(90±5)%，RWC=(75±5)%，RWC=(50±5)% on osmoregulation substances，enzyme protection system and expression of plasma membrane hole protein genePIP2-3 inTaraxacummongolicumHand.-Mazz.. Important findings：Under soil drought stress could significantly increase the dandelion leaf blade soluble sugar，soluble protein and free proline content，enhance the activity of SOD，POD and CAT，light stress show a tendency of gradually rising while severe stress showed a trend of first increase after decrease (except blade soluble sugar). Expression of plasma membrane hole protein genePIP2-3 relative quantity increased significantly，and mild stress (MS) was higher than severe stress (SS). After restore water 7 d，the accumulation of osmotic regulation substances and the content of SOD decreased,but still significant in CK.The content of POD，CAT and plasma membrane hole protein genePIP2-3 back to normal. This means that under drought stress，the dandelion can increase the accumulation of osmotic regulation substances and enhance the protective enzyme systems activities to improve plant resistance，increase plasma membrane hole relative expression of protein gene to strengthen water transport capacity.

Dandelion；Drought stress；Osmoregulation substances；Enzyme protection system；Plasma membrane hole protein

2017-05-26

四川省教育厅项目(10ZB044)

王一鸣(1992-)，男，四川绵阳人，在读硕士，主要从事生物技术与遗传育种研究。

贺忠群(1971-)，女，重庆开县人，教授，博士，主要从事蔬菜逆境生理及生物改良研究。

S647.03

A

1000-7091(2017)04-0085-06

10.7668/hbnxb.2017.04.014